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罕見(jiàn)病的診斷和治療一直是醫(yī)療領(lǐng)域的重點(diǎn)話題，長(zhǎng)期以來(lái)，孟德?tīng)栠z傳病的準(zhǔn)確診斷一直困擾著臨床工作者。在罕見(jiàn)孟德?tīng)栠z傳病的診斷中，有的家族的“診斷旅程”甚至?xí)L(zhǎng)達(dá)三四十年，極大的影響患者的生活。但最近的一項(xiàng)研究讓臨床工作者和患者家屬看到了新的希望，即轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)可以提高罕見(jiàn)孟德?tīng)栠z傳病的診斷率，具體怎么回事呢，今天小編就為大家來(lái)揭秘~

2019年2月28日在美國(guó)權(quán)威期刊The American Journal of Human Genetics發(fā)表了一篇關(guān)于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序提高診斷罕見(jiàn)孟德?tīng)栠z傳病的文章《Expanding the Boundaries of RNA Sequencing as a Diagnostic Tool for Rare Mendelian Disease》^[1]。接下來(lái)讓我們看看轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是如何發(fā)揮其強(qiáng)大的檢測(cè)功能吧！

目前，基因panel和全外顯子（WES）分析是孟德?tīng)柤膊⊥蛔儥z測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法，然而，實(shí)現(xiàn)的診斷準(zhǔn)確率最多為50％^[2]。全基因組測(cè)序（WGS）是一種潛在的診斷策略，但還無(wú)法對(duì)有超過(guò)300萬(wàn)個(gè)SNVs（single nucleotide variants）的樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)精準(zhǔn)分析，有證據(jù)表明9％至30％的非編碼區(qū)致病突變會(huì)影響RNA的加工和表達(dá)^[3]。此外，非編碼區(qū)以及影響RNA剪接和表達(dá)的編碼區(qū)的突變位點(diǎn)變化通常需要在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行額外的功能研究。

作者對(duì)基因panel或WES診斷為陰性的病例進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，診斷出36%（9/25）為陽(yáng)性，在編碼和非編碼外顯子以及內(nèi)含子區(qū)域中鑒定了致病突變，突變的病理機(jī)制由轉(zhuǎn)錄抑制、外顯子跳躍和內(nèi)含子保留等可變剪切事件造成。

01 樣品選擇29個(gè)家族（其中4個(gè)家族已經(jīng)被鑒定為陽(yáng)性病例，其余25個(gè)家族的樣品經(jīng)過(guò)基因panel或WES分析鑒定為陰性）的70個(gè)樣品，從肌肉活組織，成纖維細(xì)胞和t-肌管中提取總RNA，進(jìn)行RNA-seq。

02  RNA-seq診斷算法將未診斷的個(gè)體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（25個(gè)家族）與數(shù)據(jù)庫(kù)和從GTEx（Genotype-Tissue Expression Project健康個(gè)體）獲得的對(duì)照轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。

03 將已知的神經(jīng)肌肉疾病中突變的基因（n=132）作為鑒定突變的驗(yàn)證基因，然后聚焦于以下幾個(gè)方面進(jìn)行分析（圖1）：a.新的剪接事件，b.等位基因不平衡表達(dá)，c.基因差異表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，d.臨床相關(guān)的罕見(jiàn)序列突變。

圖1 診斷方案梗概^[1]

01 RNA-seq驗(yàn)證選材的適宜性

通過(guò)對(duì)不同組織樣品的相關(guān)性驗(yàn)證得出：實(shí)驗(yàn)組的肌肉組織與健康組的肌肉組織相關(guān)性最高，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組的取樣比較適宜。而血液樣品對(duì)于診斷神經(jīng)肌肉型病例不是理想的診斷材料。

圖2 樣品分布和基因表達(dá)譜^[1]

02 RNA-seq鑒定樣品的低頻新剪接事件

RNA加工中的異常是潛在的突變病理機(jī)制，RNA-seq可以捕獲這種異常。在25個(gè)經(jīng)poly A富集的肌肉組織轉(zhuǎn)錄本中，鑒定了166個(gè)新的剪接位點(diǎn)， 其中84個(gè)在樣品組中以低頻率存在（定義為低頻新剪接事件Low-frequency novel junctions，LFNJs），變異類型分為新受體、新供體、外顯子跳躍和偽外顯子。

圖3 低頻新剪接事件^[1]

03 RNA-seq鑒定基因組突變位點(diǎn)、表達(dá)異常和等位基因不平衡表達(dá)

在9個(gè)病例中鑒定了致病突變位點(diǎn)，另外在5'非翻譯區(qū)（UTR）中發(fā)現(xiàn)了罕見(jiàn)突變位點(diǎn)。7個(gè)先前未確診的家族中發(fā)現(xiàn)候選基因表達(dá)異常。在RYR1（異常連接）和GMPPB（5' UTR突變體）突變的情況下觀察到等位基因失衡，在3例病例中，等位基因不平衡表達(dá)是致病因素。

圖4 對(duì)突變位點(diǎn)、表達(dá)圖譜、等位基因不平衡表達(dá)^[1]

Duang！Duang！Duang！~

通過(guò)對(duì)假陰性樣品轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與健康對(duì)照組以及數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析得出孟德?tīng)栠z傳病的突變位點(diǎn)、剪接位點(diǎn)、等位基因表達(dá)不平衡等，實(shí)現(xiàn)對(duì)假陰性罕見(jiàn)孟德?tīng)栠z傳病的診斷，可作為臨床診斷的補(bǔ)充。總之，RNA-seq可縮短罕見(jiàn)孟德?tīng)栠z傳病的“診斷旅程”，為患者帶來(lái)新的希望。

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參考文獻(xiàn)：

[1] Hernan D. Gonorazky, Sergey Naumenko, Arun K. Ramani, et al. Expanding the Boundaries of RNA Sequencing as a Diagnostic Tool for Rare Mendelian Disease[J]. The American Journal of Human Genetics, 2019, 104(3):466-483.

[2] Kress W, Rost S, Kolokotronis K, et al. The Genetic Approach: Next Generation 

Sequencing Based Diagnosis of Congenital and Infantile Myopathies/ Muscle Dystrophies[J]. Neuropediatrics, 2017: s-0037-1602660.

[3] Stenson P D, Mort M, Ball E V, et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies[J]. Human Genetics, 2017, 136(6):665-677.