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整體課題綜合解決方案、動物實(shí)驗(yàn)、外泌體實(shí)驗(yàn)、甲基化測序、細(xì)胞自噬等實(shí)驗(yàn)任你選擇
環(huán)狀RNA（circRNA）是一類特殊的非編碼RNA分子，主要位于細(xì)胞質(zhì)或儲存于外泌體中，不受RNA外切酶影響，表達(dá)更穩(wěn)定且不易降解，已被證明廣泛存在于多種真核生物體內(nèi)，近年來是RNA領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
這次分享的是發(fā)表在Autophagy（IF=11.059）上的文章，研究發(fā)現(xiàn)在肺癌中circHIPK3參與調(diào)控自噬通路。
文章題目：Circular RNA circHIPK3 modulates autophagy via MIR124-3p-STAT3-PRKAA/AMPKα signaling in STK11 mutant lung cancer.
主要研究結(jié)果：
1、circHIPK3在肺癌細(xì)胞中廣泛表達(dá)；
2、干擾circHIPK3抑制細(xì)胞增殖和侵襲；
3、circHIPK3參與調(diào)控細(xì)胞自噬；
4、circHIPK3通過MIR124-3p/STAT3/PRKAA通路影響細(xì)胞自噬；
5、肺腺癌中circHIPK3:linHIPK3與患者預(yù)后有關(guān)；
6、circHIPK3調(diào)控細(xì)胞自噬的機(jī)制模型。
1、circHIPK3在肺癌細(xì)胞中廣泛表達(dá)
circHIPK3在肺癌細(xì)胞中廣泛高表達(dá)，主要定位于胞質(zhì)中，而LinHIPK3在細(xì)胞核中更豐富。為分析circHIPK3的功能和機(jī)制，作者設(shè)計(jì)并驗(yàn)證了特異性靶向circHIPK3的siRNA（si-circ-1和si-circ-2），靶向linHIPK3的siRNA（si-lin），以及靶向circHIPK3和linHIPK3的siRNA（si-both），經(jīng)驗(yàn)證這些siRNA都可以有效的對靶分子產(chǎn)生干擾作用。
2、干擾circHIPK3抑制細(xì)胞增殖和侵襲
將si-ctr、si-circ-1、si-circ-2、si-lin、si-lin轉(zhuǎn)染肺癌的不同細(xì)胞中（A549、H838、 H1299），通過分析細(xì)胞增殖曲線，克隆形成及細(xì)胞侵襲等實(shí)驗(yàn)；發(fā)現(xiàn)干擾circHIPK3可顯著抑制細(xì)胞增殖、侵襲及克隆形成，但干擾linHIPK3沒有明顯變化。
3、circHIPK3參與調(diào)控細(xì)胞自噬
A549細(xì)胞和H838細(xì)胞中干擾circHIPK3可顯著增強(qiáng)LC3B-I，降低p62（SQSTM1），表明可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。但在H1299細(xì)胞中，這一現(xiàn)象卻并不明顯；A549和H838中干擾circHIPK3可同時增加自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量，說明干擾circHIPK3能夠誘導(dǎo)自噬，但干擾linHIPK3卻導(dǎo)致自噬流下降；Si-both則逆轉(zhuǎn)干擾linHIPK3的現(xiàn)象。在H1299細(xì)胞中，干擾circHIPK3和linHIPK3均降低自噬流。
用細(xì)胞自噬抑制劑（3-MA和Bfa-1），分別處理細(xì)胞A549和H838，干擾circHIPK3后細(xì)胞增殖的影響減弱，說明在這兩種細(xì)胞中干擾circHIPK3導(dǎo)致的細(xì)胞增殖抑制的確與細(xì)胞自噬有關(guān)。但在H1299細(xì)胞中，兩種藥物處理后不能逆轉(zhuǎn)干擾circHIPK3抑制增殖的現(xiàn)象。這些發(fā)現(xiàn)表明circHIPK3部分通過細(xì)胞自噬作用影響細(xì)胞增殖。
4、circHIPK3通過MIR124-3p/STAT3/PRKAA通路影響細(xì)胞自噬
已知：MIR124-3p是有抑癌功能的miRNA，circHIPK3中存在MIR124-3p的結(jié)合位點(diǎn)，同時，MIR124-3p還可以靶向IL6R和STAT3。
作者驗(yàn)證了MIR124-3p/STAT3通路在circHIPK3與細(xì)胞自噬的相關(guān)性的機(jī)制，結(jié)果表明circHIPK3可通過競爭性結(jié)合MIR124-3p，促進(jìn)STAT3通路的激活；三種細(xì)胞中干擾circHIPK3都可以影響STAT3的磷酸化，而干擾STAT3后三種細(xì)胞自噬均升高。
通過Western分析STK11和phospho-PRKAA/AMPKα的變化。發(fā)現(xiàn)干擾circHIPK3時A549 和H838中phospho-PRKAA/AMPKα增高，但在H1299中卻降低。circHIPK3和linHIPK3對phospho-PRKAA/AMPKα的效應(yīng)也是相反的。在A549和H838中phospho-PRKAA的水平與STAT3磷酸化水平也是負(fù)相關(guān)的。在A549和H838中干擾PRKAA后，LC3B-I增多，自噬流降低，細(xì)胞自噬受到抑制。分別干擾STAT3和PRKAA看相互影響情況，結(jié)果表明在三種細(xì)胞系中均存在STAT3對PRKAA的調(diào)控作用，而PRKAA對STAT3的調(diào)控作用僅能在A549細(xì)胞中檢測出。
CCLE數(shù)據(jù)庫中分析表明A549 和H838中STK11表達(dá)較低， H1299中反之。H1299中干擾STK11后，再干擾circHIPK3就可以顯著提高細(xì)胞自噬。這表明H1299中出現(xiàn)之前的特殊現(xiàn)象主要是因?yàn)榇嬖诟呋钚缘腟TK11，導(dǎo)致PRKAA的旁路激活，抵消了circHIPK3通過STAT3影響PRKAA的效應(yīng)。
5、肺腺癌中C:L與患者預(yù)后有關(guān)
臨床標(biāo)本中分析表明，癌組織與癌旁組織中circHIPK3表達(dá)豐度相近，但線性HIPK3的表達(dá)差別較明顯，癌組織中l(wèi)inHIPK3顯著下調(diào)。通過統(tǒng)計(jì)C:L，發(fā)現(xiàn)在癌組織中這一指標(biāo)顯著增高，且與臨床分期和預(yù)后有很高的相關(guān)性，這一比值越高，預(yù)后越差。
6、circHIPK3調(diào)控細(xì)胞自噬機(jī)制模型
通過研究并分析，作者找出了一個circHIPK3調(diào)控細(xì)胞自噬的機(jī)制模型。在A549和H838細(xì)胞中，STK11攜帶突變，且表達(dá)較低。circHIPK3可競爭性結(jié)合并抑制MIR124-3p，STAT3和IL6R都是MIR124-3p的靶基因。高豐度的circHIPK3吸附了MIR124-3p，導(dǎo)致STAT3的磷酸化水平升高和活化，STAT3負(fù)調(diào)控PRKAA的活性。PRKAA活性與細(xì)胞自噬流正相關(guān)。因此在A549和H838細(xì)胞中，通過干擾circHIPK3能夠最終促進(jìn)PRKAA磷酸化和細(xì)胞自噬流升高。但在H1299中，存在野生型的STK11且表達(dá)豐度較高，該基因可直接作用于PRKAA并促進(jìn)細(xì)胞自噬流，在H1299細(xì)胞中，干擾circHIPK3對PRKAA影響被高活性的STK11所掩蓋。
參考文獻(xiàn)：Chen Xiuyuan,Mao Rui,Su Wenmei et al. Circular RNA modulates autophagy via -STAT3-PRKAA/AMPKα signaling in STK11 mutant lung cancer.[J] .Autophagy, 2019, undefined: undefined.
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