我們?cè)谟醚簶颖具M(jìn)行基因檢測(cè)的時(shí)候，有時(shí)候血液會(huì)出現(xiàn)溶血等質(zhì)量問題，這嚴(yán)重影響了樣本的正常檢測(cè)，給我們的工作帶來了極大困擾。那么溶血會(huì)產(chǎn)生什么影響？是什么因素導(dǎo)致溶血的？怎樣才能避免溶血事件的發(fā)生呢？
溶血的影響
紅細(xì)胞破裂，血紅蛋白逸出稱為紅細(xì)胞溶解，簡(jiǎn)稱溶血，它可由多種理化因素和毒素引起。嚴(yán)重溶血下，標(biāo)本不可用，血紅蛋白及其代謝產(chǎn)物可能抑制Taq酶活性，使PCR擴(kuò)增效率明顯降低。
圖1 4號(hào)、5 號(hào)樣本屬于溶血樣本，需要重新采血
溶血的原因
1、患者本身因素。若患者有自身溶血性貧血、高膽紅素血癥等疾病時(shí)，抽出的血液可能已為溶血狀態(tài)。
2、穿刺困難。患者由于某些原因?qū)е卵鞑粫郴驀?yán)重脫水、休克、惡病質(zhì)等造成末梢循環(huán)差，靜脈充盈不良，均可導(dǎo)致穿刺困難，采血時(shí)間延長(zhǎng)，部分血液凝固，細(xì)胞機(jī)械破壞,造成溶血。
3、操作不當(dāng)。采血者在采血部位消毒液未干的情況下即進(jìn)行穿刺，或采血時(shí)將止血帶扎得過緊、時(shí)間太長(zhǎng)，或在采血時(shí)定位或進(jìn)針不準(zhǔn),使得針尖在靜脈中反復(fù)進(jìn)出，這些不當(dāng)操作均可造成標(biāo)本溶血。將血液注入試管時(shí)速度過快或混勻血液與抗凝劑的過程中動(dòng)作過猛，造成紅細(xì)胞撞擊,導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂。
4、抽血器具不合格。臨床上所用的抽血器具一般為一次性塑料制品，不合格的塑料制品會(huì)因聚合不完全而具有毒性引起血標(biāo)本溶血。若玻璃試管不干燥或不清潔也會(huì)造成溶血?？鼓嚬苤锌鼓齽┢僖部蓪?dǎo)致溶血。
5、存放、運(yùn)送和分離不當(dāng)。血標(biāo)本采集好后未馬上送檢，放置時(shí)間過長(zhǎng)，造成溶血。運(yùn)送途中劇烈振蕩致使紅細(xì)胞撞擊破裂而溶血。離心速度太快,也可導(dǎo)致溶血。
那如何才能避免溶血呢？科學(xué)規(guī)范的操作是非常必要的。
血液采集、儲(chǔ)存、運(yùn)輸
1.采血管
采血管常見有兩類：
（1）cfDNA專用常溫采血管：特指Streck Cell-Free DNA BCT? Blood Collection Tubes (10ml) ， 后文中用Streck cfDNA常溫采血管或Streck管指代。
（2）EDTA管
禁用肝素抗凝管：由于肝素使得DNA抽提得率降低并在DNA提取過程中難以去除，肝素也會(huì)導(dǎo)致PCR效率降低，因此cfDNA檢測(cè)血液采集禁用肝素抗凝管。
2. 使用Streck cfDNA常溫采血管采集、儲(chǔ)存、運(yùn)輸血液
（1） 血液采集操作流程：
1). 依據(jù) CLSI H3-A6 指南或當(dāng)?shù)刂改喜杉o脈血
防止回流: 由于Streck 管含有化學(xué)添加物，必須避免血液回流。為防止回流，應(yīng)采取以下措施：
a. 在采血過程中保持患者胳膊處于下方
b. 保持采血管和管塞處于上方，防止采血管管內(nèi)容物觸及管塞或針的末端
c. 在血液開始流入采血管時(shí)立即或在兩分鐘內(nèi)釋放止血帶
2). 遵循 CLSI H3-A6 或當(dāng)?shù)刂改匣驅(qū)嶒?yàn)室準(zhǔn)則采血
3). 采集10ml血液，完全填滿采血管
4). 從適配器上取下采血管，握住采血管，立即輕柔顛倒10次。顛倒不充分或顛倒不及時(shí)均可能導(dǎo)致提取結(jié)果欠佳。一次完整顛倒包含手腕完全旋轉(zhuǎn)180度再折回，如下圖所示：
圖2 采血管顛倒混勻
（2）血液儲(chǔ)存及運(yùn)輸
為保證后續(xù)血漿分離及cfDNA提取質(zhì)量，Streck管禁止冷藏/冷凍血液標(biāo)本，建議常溫保存及運(yùn)輸(6-36℃)至指定實(shí)驗(yàn)室。從采血至運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室檢測(cè)的時(shí)間間隔不超過3天。
3. 使用EDTA管(10ml) 采集、儲(chǔ)存、運(yùn)輸血液
（1）遵循標(biāo)準(zhǔn)靜脈采血程序采集10ml血液, 輕柔顛倒6-8次以混勻標(biāo)本，切勿搖晃.
（2）禁止冷凍血液標(biāo)本，建議4℃保存。
（3）血液應(yīng)盡快離心處理，1小時(shí)內(nèi)處理最佳，至多不超過2小時(shí)。本操作流程包括兩步離心，以防止最終樣本中出現(xiàn)基因組DNA/RNA污染。
4. 采血量的要求
（1）不同平臺(tái)對(duì)血漿量的要求量不一樣，一般要求采用 10mL 采血管，10ml 血液大約能分離出 4-5ml 血漿。
（2）對(duì)同一患者，血漿量越多，所提取的DNA量就越多，其中含有的 cfDNA量也就越高，對(duì)檢測(cè)越有利
圖3 對(duì)同一患者，血漿量越多，所提取的DNA量就越多，其中含有的 cfDNA量也就越高(Sherwood et al. 2016 PLoSONE)
5. 血液采集后送到實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)所能允許的最大時(shí)間間隔
（1）兩小時(shí)內(nèi)處理標(biāo)本能最大程度避免血細(xì)胞破裂而造成基因組DNA (gDNA) 污染
圖4 A. 2h 內(nèi)處理標(biāo)本，不論采用 EDTA管還是 cfDNA BCT 管，DNA濃度均無顯著差異; B. 72h 內(nèi)處理標(biāo)本，不論 EDTA管還是 cfDNA BCT 管，DNA 濃度較 2h 時(shí)均顯著提高，即 gDNA 污染增加(Sherwood et al. 2016 PLoSONE)
（2）不能在兩小時(shí)內(nèi)處理標(biāo)本時(shí)，cfDNA BCT(Streck)管 優(yōu)于 EDTA 管
圖5 左圖，2h 內(nèi)處理標(biāo)本，EDTA管和 cfDNA BCT 管無顯著差異; 右圖，72h內(nèi)處理標(biāo)本時(shí)，EDTA 管DNA濃度顯著高于cfDNA BCT 管，即 EDTA 管中 gDNA 污染顯著高于 cfDNA BCT 管(Sherwood et al 2016 PLoSONE)
（3）不同采血管所能允許的最大時(shí)間間隔
1）Streck 管：從采血至運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室檢測(cè)的時(shí)間間隔不超過3天。
2）EDTA 管：強(qiáng)烈建議在醫(yī)院離心，分離出血漿之后干冰運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。從采血至分離血漿至多不能超過2小時(shí)。
6. 血液采集后送往實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)前的保存方式和條件
（1）Streck 管：血液應(yīng)該在室溫（6℃-36℃）儲(chǔ)存，在室溫（6℃-36℃）環(huán)境下運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。
（2）EDTA 管：從采血至運(yùn)輸?shù)街行膶?shí)驗(yàn)室離心處理至多不能超過2h，離心前臨時(shí)保存應(yīng)暫放于2~8℃冷藏。分離血漿后，應(yīng)立即豎直放置，冷凍血漿，-80℃冷凍最佳（或-20℃冷凍直至干冰運(yùn)輸）。
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