關(guān)鍵詞：代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)，腫瘤細(xì)胞系，犬尿氨
在癌癥中，遺傳或表觀遺傳變化會(huì)干擾關(guān)鍵酶的活性或重組致癌途徑，并導(dǎo)致細(xì)胞代謝異常。癌癥中特定的代謝依賴性是有效治療的關(guān)鍵基礎(chǔ)，尋找新型癌癥藥物靶點(diǎn)一定程度上受限于癌癥代謝研究多從小部分細(xì)胞系中得出結(jié)論，但整體、全面刻畫癌癥代謝譜具有一定難度。現(xiàn)無針對(duì)來源、遺傳背景全面的細(xì)胞系進(jìn)行的系統(tǒng)分析。并且，目前也沒有相關(guān)的高通量方法可以通過干擾多種細(xì)胞系的相關(guān)代謝通路來評(píng)估癌癥的代謝需求，因此，新型抗癌代謝靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)得益于高質(zhì)量、全面的代謝數(shù)據(jù)分析。
近期發(fā)表在《Nature Medicine》上的一篇題為：The landscape of cancer cell line metabolism的文章，進(jìn)一步揭示癌癥代謝多樣性。作者使用LC-MS對(duì)928種細(xì)胞系的225種代謝物進(jìn)行分析 (來自于20多種癌癥)，通過關(guān)聯(lián)分析將癌癥代謝與表觀遺傳學(xué)等有效關(guān)聯(lián)。通過細(xì)胞條形碼技術(shù)證實(shí)ASNS超甲基化使得胃癌和肝癌對(duì)天冬酰胺酶治療敏感。最后揭示犬尿氨酸 (一種免疫抑制代謝物) 在模型癌細(xì)胞系中的獨(dú)特合成和分泌模式。該研究結(jié)果及方法對(duì)癌癥代謝提供了全面的分析，為癌癥治療奠定理論基礎(chǔ)。
The landscape of cancer cell line metabolism
組學(xué)技術(shù)方法
代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)
研究結(jié)果
1. CCLE細(xì)胞系代謝產(chǎn)物組成
對(duì)主要的20種癌癥類型的928種細(xì)胞系進(jìn)行體外培養(yǎng)，并對(duì)124種極性和101種脂質(zhì)進(jìn)行代謝譜分析，樣本分4批進(jìn)行檢測(cè)，使用所有樣本混合作為參考，以保證數(shù)據(jù)質(zhì)量。
使用層次聚類的方法評(píng)估細(xì)胞系之間代謝物組成的相似性，形成2個(gè)主要的簇與造血和非造血譜系密切相關(guān)。為進(jìn)一步量化代謝物水平 (y) 與主要癌癥譜系 (X) 的關(guān)聯(lián)程度，采用線性回歸模型進(jìn)行分析。148/225與其有線性關(guān)系，為了獲得譜系的特異性分布，同時(shí)評(píng)估主要癌癥譜系中每一個(gè)代謝物的平均豐度，表明不同模型癌細(xì)胞系代謝譜系存在差異。
2. 代謝物與遺傳特征的關(guān)系
癌癥的發(fā)生與發(fā)展除了受代謝物組成變化影響外，遺傳/表觀遺傳變化也可能改變細(xì)胞代謝，為了確定是否歸因于遺傳差異的代謝變異，進(jìn)一步構(gòu)建包括705個(gè)基因突變及61個(gè)基因擴(kuò)增/缺失的遺傳特征矩陣。應(yīng)用線性回歸模型揭示這些遺傳特征和代謝物水平之間的關(guān)系。如研究發(fā)現(xiàn)KEAP1突變 (作為遺傳特征) 與谷胱甘肽 (GSH/GSSG) 和NADP+具有顯著的相關(guān)性。平均而言，在具有突變KEAP1的癌細(xì)胞株中，這些氧化還原代謝產(chǎn)物的含量約為其對(duì)照兩倍。值得注意的是，許多常見的致癌因子如EGFR、KRAS、NRAS、TP53、PTEN、TSC1/2與代謝物組成具有顯著性較弱或無顯著性的相關(guān)性。通過在代謝物和各種遺傳特征之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，證實(shí)先前發(fā)現(xiàn)的致癌因子變化 (如IDH1、KEAP1、ME2) 與異常代謝物水平有關(guān)。
圖1 CCLE數(shù)據(jù)庫實(shí)現(xiàn)與遺傳特征相關(guān)的定量代謝組學(xué)建模
3. DNA甲基化調(diào)節(jié)代謝物豐度
通過檢測(cè)DNA甲基化評(píng)估其與代謝物水平的關(guān)系。在本研究中，2114個(gè)基因的mRNA與啟動(dòng)子CpG甲基化水平顯著相關(guān)：1、DNA的超甲基化可能通過抑制某些代謝物降解途徑影響代謝物水平；如SLC25A20甲基化與長(zhǎng)鏈酰基肉堿 (如烯基肉堿) 的積累密切相關(guān)，其超甲基化與mRNA轉(zhuǎn)錄減少及具有14個(gè)、16個(gè)或18個(gè)碳原子的?；鈮A類物質(zhì)含量顯著升高相關(guān)，但與其他具有較短或較長(zhǎng)酰基鏈的?；鈮A含量無關(guān)；2、DNA超甲基化可能通過限制生物合成途徑來調(diào)節(jié)代謝物水平；如脯氨酸水平降低與Pycr1的超甲基化有關(guān)，Pycr1編碼一種可將吡咯啉-5-羧酸鹽轉(zhuǎn)化為脯氨酸的酶。該部分研究工作評(píng)估DNA甲基化對(duì)于細(xì)胞內(nèi)代謝物濃度的調(diào)控作用。
圖2 代謝產(chǎn)物與DNA甲基化相關(guān)性的系統(tǒng)評(píng)價(jià)
4. 代謝物依賴關(guān)系分析
代謝依賴性關(guān)聯(lián)分析表明，在癌細(xì)胞系中觀察到的不同代謝表型與不同的基因依賴性配對(duì)，可能存在潛在的治療靶點(diǎn)。作者重點(diǎn)關(guān)注前3000種依賴基因并突出其與氧化還原平衡、氨基酸和脂類代謝的關(guān)系。氧化還原代謝產(chǎn)物包括 GSH、GSSG 和 NADP+的異常積累與 NFE2L2 (NRF2) 的敲除敏感性增加有關(guān)，其中NFE2L2 是一種參與抗氧化反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄激活因子。同時(shí)，作者也發(fā)現(xiàn)天冬酰胺水平較低的細(xì)胞更依賴于其合成酶 (ASNS) 和 EIF2AK4 (GCN2，參與氨基酸饑餓反應(yīng))。通過關(guān)聯(lián)分析可知體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞系脂質(zhì)組成具有顯著差異。
圖3代謝依賴關(guān)系的系統(tǒng)評(píng)價(jià)
5. CCLE細(xì)胞系的表型分析
如上所述，低的天冬酰胺表達(dá)水平與天冬酰胺合成酶 (ASNS) 缺失的敏感性增加顯著相關(guān)。作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)天冬酰胺受限時(shí)，ASNS敲減可顯著抑制細(xì)胞增殖。一些ASNS啟動(dòng)子超甲基化的CCLE細(xì)胞系具有異常低的ASNS表達(dá) (即使在轉(zhuǎn)錄激活子ATF4存在的條件下)，因此作者推測(cè)內(nèi)在甲基化依賴型基因抑制選擇性地針對(duì)特定的營(yíng)養(yǎng)缺乏。為進(jìn)一步驗(yàn)證該推論，作者使用24個(gè)核苷酸barcodes標(biāo)記的544種CCLE細(xì)胞系混合后在氨基酸組成明確的條件下培養(yǎng)，并在處理6天后使用barcode高通量測(cè)序的方法評(píng)估細(xì)胞活力。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在天冬酰胺限制條件下生長(zhǎng)時(shí)，具有異常低表達(dá)ASNS的那些被選擇性地耗盡。該部分研究工作表明DNA超甲基化影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用的依賴性，如癌細(xì)胞系中天冬酰胺、精氨酸和谷氨酰胺的營(yíng)養(yǎng)缺陷。
圖4癌細(xì)胞系篩查揭示氨基酸代謝營(yíng)養(yǎng)缺陷
6. 天冬酰胺酶潛在的治療作用
作者在研究中發(fā)現(xiàn)天冬酰胺超甲基化的細(xì)胞同時(shí)也缺乏蛋白質(zhì)表達(dá)，在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)天冬酰胺酶具有高度敏感性。為確認(rèn)該依賴性是否存在于體內(nèi)，作者將2313287 (ASNS high) 或 SNU719 (ASNS low) 細(xì)胞皮下植入于裸鼠兩側(cè)；當(dāng)腫瘤體積達(dá)100-200 mm3后，腹腔注射天冬酰胺酶，并監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNU719腫瘤的生長(zhǎng)顯著降低，而2313287腫瘤無顯著變化。在TCGA中檢測(cè)了胃癌和肝癌的DNA甲基化，發(fā)現(xiàn)其與腫瘤樣本中ASNA表達(dá)量降低顯著相關(guān)。以上結(jié)果均表明天冬酰胺酶在體外和體內(nèi)均可通過抑制ASNS表達(dá)缺失的癌細(xì)胞生長(zhǎng)。
圖5天冬酰胺酶對(duì)胃癌和肝癌的治療意義
7. CCLE 中的犬尿氨酸代謝分析
除了分析具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的代謝產(chǎn)物外，作者也探索了信號(hào)代謝產(chǎn)物的表達(dá)模式，如犬尿氨酸。犬尿氨酸由色氨酸分解代謝產(chǎn)生，通過芳基烴受體 (AHR) 發(fā)揮免疫抑制作用，從而抑制效應(yīng)T細(xì)胞增殖，增強(qiáng)調(diào)節(jié)T細(xì)胞生成。具有較高胞內(nèi)犬尿氨酸濃度的細(xì)胞系具有較高的向胞外分泌活性。
圖6 CCLE中的犬尿氨酸代謝分析
小結(jié)與啟示
迄今為止，暫無針對(duì)不同遺傳背景的多種模型癌細(xì)胞系代謝組的系統(tǒng)分析，針對(duì)該問題，作者分析了928 種癌細(xì)胞系中的 225 種代謝產(chǎn)物，通過大規(guī)模的數(shù)據(jù)采集和分析，系統(tǒng)性研究了代謝物的表達(dá)模式，對(duì)藥物靶點(diǎn)的篩選具有重要意義。同時(shí)，作者也指出在大規(guī)模代謝組學(xué)研究工作中 (本研究工作) 存在一定的局限性：1、生物學(xué)重復(fù)在大規(guī)模代謝組學(xué)研究工作中的重要性 (大部分細(xì)胞系僅使用一個(gè)生物學(xué)重復(fù))；2、檢測(cè)更多的代謝物，全面解析代謝通路 (中科新生命推出的非耙向代謝組學(xué)所使用的自建庫包含2700多種代謝物的標(biāo)準(zhǔn)譜圖)；3、受研究規(guī)模限制，無法使用代謝流的動(dòng)態(tài)測(cè)量，只可檢測(cè)代謝物的穩(wěn)態(tài)水平；4、用于組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基與體內(nèi)環(huán)境仍然存在顯著差異；因此腫瘤樣本的大規(guī)模代謝組學(xué)分析是下一步研究的重點(diǎn)，相關(guān)問題提出對(duì)后續(xù)研究工作具有重要的啟示意義。
中科新生命自2014年即推出代謝組學(xué)服務(wù)，是市面上最早提供代謝組學(xué)服務(wù)的平臺(tái)之一，2700+代謝物標(biāo)品二級(jí)譜圖數(shù)據(jù)庫+人工二次確認(rèn)，雙重保障定性結(jié)果，歡迎有檢測(cè)需求的老師前來咨詢。
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