鹿明
生物
蛋白、代謝組學(xué)服務(wù)專家
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前言
2019年7月，北京大學(xué)口腔醫(yī)院課題組在Therapeutic Advances in Chronic Disease（IF=4.45）發(fā)表題為“Lactobacillus rhamnosus GG attenuates tenofovir disoproxil fumarate-induced bone loss in male mice via gut-microbiota-dependent anti-inflammation”的研究論文，該研究報(bào)道了補(bǔ)充益生菌可能對(duì)骨質(zhì)疏松癥有效，本文作為此項(xiàng)研究的先導(dǎo)對(duì)其中的影響機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的探索。
基本信息
英文標(biāo)題：Lactobacillus rhamnosus GG attenuates tenofovir disoproxil fumarate-induced bone loss in male mice via gut-microbiota-dependent anti-inflammation
中文標(biāo)題：鼠李糖乳酸桿菌GG通過(guò)依賴腸道菌群的抗炎作用減輕富馬酸替諾福韋二吡呋酯誘導(dǎo)的雄性小鼠骨質(zhì)疏松
材料：小鼠糞便
影響因子：4.45
發(fā)表期刊：Therapeutic Advances in Chronic Disease
主要運(yùn)用鹿明生物技術(shù)：LC-MS普篩
研究背景
觀察發(fā)現(xiàn)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物會(huì)引發(fā)感染免疫缺陷病毒患者的骨質(zhì)流失，而富馬酸替諾福韋二吡呋酯（TDF）會(huì)引起嚴(yán)重的骨損傷，例如骨質(zhì)疏松癥。補(bǔ)充益生菌（例如Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）可能對(duì)骨質(zhì)疏松癥有效，但目前影響機(jī)制尚不清楚，本文對(duì)此進(jìn)行了探索。
研究思路
（一）實(shí)驗(yàn)分組
6周大雄性小鼠，分為五組（每組10-12只），每組喂食不同藥物，持續(xù)8周：
①對(duì)照組（Sham）：只服用生理鹽水；
②LGG+TDF組：每日服用相同劑量（0.86 mg）TDF，一周兩次服用固定劑量LGG；
③大腸桿菌++TDF組：每日服用相同劑量（0.86 mg）TDF，一周兩次服用固定劑量大腸桿菌；
④陰性對(duì)照組（TDF組）：每日只服用相同劑量（0.86 mg）TDF；
⑤陽(yáng)性對(duì)照（ZOL+TDF組）：前4周，每周1次皮下注射ZOL（唑來(lái)膦酸），每日服用相同劑量（0.86 mg）TDF。
（二）檢測(cè)方法
① 顯微CT、骨切片和彎曲測(cè)試評(píng)估骨形態(tài)測(cè)量和生物力學(xué)。
② 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞，促炎細(xì)胞因子和腸道通透性水平。
③ 16S重組脫氧核糖核酸焦磷酸測(cè)序分析腸道微生物群組成
④ 超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜分析代謝組。
結(jié)果分析
1.服用LGG可減輕TDF引起的骨質(zhì)流失
LGG + TDF組小鼠在8周時(shí)體重明顯低于大腸桿菌+ TDF和TDF組。為了研究LGG在TDF誘導(dǎo)的骨質(zhì)丟失中的作用，作者使用骨密度、骨形態(tài)測(cè)量以及顯微CT評(píng)估骨質(zhì)量和微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示在表1和圖1。在第8周LGG+TDF組顯示出骨密度顯著增加，骨形態(tài)測(cè)量和顯微CT也驗(yàn)證了該結(jié)果，表明服用LGG可減弱TDF誘導(dǎo)的骨微結(jié)構(gòu)破壞。
圖1 | 骨密度、骨形態(tài)測(cè)量以及顯微CT評(píng)估不同組別的差異
表1 | 第8周時(shí)5個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行骨密度和骨組織形態(tài)學(xué)測(cè)定
作者為了進(jìn)一步評(píng)估骨再生情況，通過(guò)顯微CT和組織形態(tài)學(xué)測(cè)量了生長(zhǎng)板厚度。結(jié)果顯示（圖2）LGG + TDF組中的生長(zhǎng)板在五組中最厚（p <0.05）。此外LGG + TDF組生長(zhǎng)板中的肥大軟骨細(xì)胞數(shù)量多于其他組，表明LGG組發(fā)生更多軟骨內(nèi)骨化。此外與ZOL + TDF和Sham組相比，大腸桿菌+ TDF和TDF組的生長(zhǎng)板明顯更薄。使用雙熒光標(biāo)記的動(dòng)態(tài)組織形態(tài)學(xué)分析也顯示LGG + TDF組中的MAR和BFR / BS比率在五組中最高（p <0.05）。
圖2 | 服用8周LGG后促進(jìn)骨轉(zhuǎn)換和軟骨內(nèi)骨化
生物力學(xué)是骨性評(píng)估的關(guān)鍵指標(biāo)。生物力學(xué)參數(shù)的結(jié)果表明（圖3）LGG + TDF組的最大載荷，極限載荷能量，楊氏模量、剛度和斷裂能量與大腸桿菌+ TDF或TDF組相比顯著增加（p < 0.05）。
圖3 | 服用LGG8周時(shí)改善另外血清骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)和生物力學(xué)特性
2. LGG可防止破骨細(xì)胞生成并調(diào)節(jié)骨髓的免疫應(yīng)答
為了確定骨質(zhì)流失是否與破骨細(xì)胞生成相關(guān)，進(jìn)行TRAP染色和ELISA分析。結(jié)果表明，與大腸桿菌+ TDF和TDF組相比，LGG + TDF、Sham和ZOL + TDF組的N.Oc / BS和Oc.S / BS顯著降低（p <0.05）。此外與大腸桿菌+ TDF和TDF組相比，LGG + TDF和ZOL + TDF組的骨髓細(xì)胞上清液的RANKL水平也顯著降低（p <0.05）。為了探索破骨細(xì)胞生成是否與炎癥有關(guān)，進(jìn)行了ELISA和FACS分析，發(fā)現(xiàn)與大腸桿菌+ TDF和TDF組相比，LGG + TDF組細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-17的濃度顯著降低（p <0.05）。
圖4 | 不同組的染色、ELISA分析、FACS分析結(jié)果
3. LGG調(diào)節(jié)腸道炎癥反應(yīng)和腸道滲透性
為研究LGG誘導(dǎo)的全身炎癥反應(yīng)，檢測(cè)血清促炎細(xì)胞因子和脾臟淋巴細(xì)胞。與大腸桿菌+TDF和TDF組相比，LGG+TDF組顯著增加Treg:CD4+T細(xì)胞和Treg:Th17細(xì)胞的比例，以及Th17:CD4+T細(xì)胞比例降低（p <0.05）。為研究腸道炎癥反應(yīng)是否引發(fā)全身炎癥反應(yīng)，作者進(jìn)行了組織學(xué)、qPCR和FACS分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明腸道炎癥狀態(tài)與腸道通透性的變化有關(guān)。Claudin蛋白（CLDN）在間隙連接蛋白合成中起關(guān)鍵作用，這對(duì)于腸道屏障的生理緊縮非常重要。
圖5&6 | LGG調(diào)節(jié)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)和腸道滲透性
4. LGG重構(gòu)腸道微生物群
為了確定LGG如何調(diào)節(jié)腸道炎癥反應(yīng)和腸道通透性，作者研究LGG對(duì)腸道微生物群的影響。首先評(píng)估腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)的整體多樣性和結(jié)構(gòu)。16S rDNA測(cè)序?qū)π∈蠹S便檢測(cè)結(jié)果顯示，具有97％同一性的529個(gè)OTU可用于評(píng)估各組之間的差異，LGG+TDF 和 ZOL+TDF的細(xì)菌多樣性和豐富度均顯著降低。此外也揭示了LGG + TDF組的菌群結(jié)構(gòu)與TDF組不相似。作者發(fā)現(xiàn)了不同實(shí)驗(yàn)組各自的優(yōu)勢(shì)菌群，其中值得注意的是，在LGG + TDF組高度豐富的物種中，乳球菌與Candidatus-Arthromitus菌群表現(xiàn)出高度的正相關(guān)。
圖7 | LGG在8周重建了腸道微生物系統(tǒng)
5.LGG改變腸道微生物代謝產(chǎn)物
作者使用基于LC-MS非靶標(biāo)代謝組學(xué)方法尋找LGG + TDF和TDF組之間的差異代謝物。OPLS-DA模型表明LGG + TDF和TDF組之間區(qū)分明顯，并從16,981個(gè)峰中找到了116個(gè)差異較大的代謝物（VIP >1.0）?；谙鄬?duì)豐度倍數(shù)變化（FC>2.5或<0.4），又從中篩選出19個(gè)顯著差異的代謝物（表2），其中有8種甘油磷脂。在LGG + TDF組的糞便樣本中有就六種甘油磷脂，并且其中兩種在TDF組也能找到?；贙EGG數(shù)據(jù)庫(kù)及代謝通路富集發(fā)現(xiàn)，LGG + TDF組的甘油磷脂代謝與TDF組相比增加（p <0.01）。此外在LGG + TDF組的六個(gè)甘油磷脂中有四個(gè)溶血磷脂酰膽堿（LysoPCs），它們可能通過(guò)抑制白細(xì)胞浸潤(rùn)、白三烯和促炎細(xì)胞因子而具有抗炎能力。值得特別注意的是，代謝產(chǎn)物N-乙?；?白三烯E4在TDF組相對(duì)含量最高，它與許多病理生理學(xué)特征（包括炎癥、哮喘和血栓形成）呈顯著正相關(guān)。
表2 LGG+TDF和TDF兩組間的19個(gè)差異代謝產(chǎn)物
小結(jié)：
①與僅服用TDF組相比，口服LGG可使骨小梁微結(jié)構(gòu)、皮質(zhì)骨量和生物力學(xué)性能顯著增加。
②LGG治療增加腸屏障完整性，擴(kuò)增了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，減少了Th17細(xì)胞，并且下調(diào)了骨髓、脾和腸中破骨細(xì)胞生成相關(guān)的細(xì)胞因子。
③LGG重建腸道微生物群結(jié)構(gòu)并改變代謝物組成，尤其是溶血磷脂酰膽堿水平。然而在TDF組N-乙?；?白三烯E4的量最高。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
LGG重建了腸道微生物群的群落結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了溶血磷脂酰膽堿的表達(dá)，并改善了腸道完整性，從而抑制了TDF誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致TDF誘導(dǎo)的小鼠骨丟失減弱。LGG益生菌可能是預(yù)防和治療TDF誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥的安全有效的策略。
圖8 | LGG減弱TDF誘導(dǎo)的骨質(zhì)丟失機(jī)制的示意圖
小鹿推薦
本文旨在探索益生菌（LGG）改善骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。首先使用多種臨床以及生理檢測(cè)手段，對(duì)構(gòu)建的5種小鼠模型進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)服用LGG確實(shí)可改善TDF引起的骨質(zhì)流失，而且從臨床角度觀察到相關(guān)癥狀的改變。這些檢測(cè)也從生理表型進(jìn)一步確認(rèn)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷牟町悺?/span>為了進(jìn)一步研究其作用機(jī)理，作者對(duì)LGG+TDF和TDF組進(jìn)行了16S rDNA測(cè)序和代謝組研究，發(fā)現(xiàn)服用LGG可重構(gòu)腸道微生物群、改變代謝物組成，并解釋了相關(guān)機(jī)理。本文基于嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、臨床和理化試驗(yàn)及多組學(xué)聯(lián)合分析（基因測(cè)序+代謝組）的整體研究思路，十分值得借鑒。
部分參考文獻(xiàn)
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