繼前期文章《全外顯子測序在臨床診斷中的應(yīng)用》簡單介紹了在臨床中應(yīng)用全外顯子組測序（WES）的優(yōu)勢，本期將接著討論WES在科研中的應(yīng)用。
基本概念
圖片來源：《醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)》[1]
外顯子（exon）通常是指基因內(nèi)的DNA編碼序列，并且最終表達(dá)為蛋白質(zhì)。外顯子組是指物種基因組中所有外顯子區(qū)域的總和。人類外顯子組包括22,000余個基因，共180,000余個外顯子。整個外顯子區(qū)域長度只有全基因組的1-2%[2]，但是卻涵蓋了大多數(shù)的單基因病致病突變[3]。
目前，NGS應(yīng)用在臨床科研中主要用于尋找疾病在分子層面的發(fā)病機(jī)制，通過對目標(biāo)基因的測序來發(fā)現(xiàn)新的基因或突變類型，并輔以功能驗證或者大樣本數(shù)據(jù)的驗證，揭示基因與疾病、基因型與表型之間的關(guān)系。
科研潛力
之前很多與遺傳病診斷相關(guān)的科研文章，由于是借助Panel分析的，大多是關(guān)于某一明確致病基因的新的變異類型或者基因型與表型的突變譜的研究，局限性比較強(qiáng)。在一些明確致病基因的回顧性研究中，Panel具有很好的性價比。
但是，在科研的探索之路上，一次性所能得到的信息越多，通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲性O(shè)計和分析，我們就越能揭開疾病最里面的那層面紗。一項產(chǎn)品是否真的適合應(yīng)用在科學(xué)研究中，最重要的就是看它的潛力，在遺傳病領(lǐng)域中，這個潛力就是發(fā)現(xiàn)新的致病基因。
下面來看下相關(guān)潛力分析。
圖片來源：OMIN
截止今年7月8號，OMIM中有5582種疾病與基因明確關(guān)聯(lián)，仍然有1560種疾病沒有明確基因關(guān)聯(lián)。人類目前一共有20000余個基因，在OMIM中有描述的也只有16112個基因，因此，一次性檢測所有基因的外顯子區(qū)域?qū)τ谛碌闹虏』虻陌l(fā)現(xiàn)還是非常有意義的。
科研可行性
i. 價格可行性：目前WES的價格已經(jīng)全面下調(diào)，可能對于不同的芯片有相關(guān)差價，但是總體價格區(qū)間都是在患者或者科研工作者的接受范圍內(nèi)，有助于樣本的累積。
ii. 分析可行性：相比于WGS而言，WES只分析位于外顯子區(qū)域的變異，因此分析更容易。
iii. 解釋可行性：由于檢測到的變異都位于外顯子區(qū)域，直接參與到蛋白質(zhì)合成，因此解釋更加容易，相關(guān)的驗證實驗也更方便設(shè)計。
具體應(yīng)用實例
下面我們就用近期發(fā)表的一些文章來看看WES在發(fā)現(xiàn)新的致病基因等科研發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用。
一、穩(wěn)妥路線：隊列分析
先看今年四月份發(fā)表在頂級醫(yī)學(xué)雜志《The New England Journal of Medicine》上的一篇文章。
圖片來源：The New England Journal of Medicine
先天性巨結(jié)腸是一種腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙疾病，是新生兒和嬰兒腸梗阻最常見的原因。這類疾病具有80%以上的遺傳性，包括一些與腸道神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的罕見和常見的基因序列變異或者是一些腸神經(jīng)發(fā)育受累及的單基因遺傳病或染色體綜合征。作者通過對190名患者進(jìn)行了全外顯子組測序以及基因分型，從單核苷酸變異、拷貝數(shù)變異到核型變異，來尋找先天性巨結(jié)腸的分子學(xué)機(jī)理[4]，通過WES的檢測，在入組患者中一共發(fā)現(xiàn)了7個疾病相關(guān)的新致病基因。
圖片來源：The New England Journal of Medicine
一句話點(diǎn)評
較大的患者群+重點(diǎn)通路富集分析+完善的功能研究+統(tǒng)計學(xué)分析，得出患者受益的相關(guān)患病風(fēng)險和遺傳咨詢依據(jù)，環(huán)環(huán)相扣。
第二篇為2016年發(fā)表在《The New England Journal of Medicine》的文章。
作者對患有神經(jīng)代謝紊亂的47個患兒進(jìn)行WES測序（其中6例落選、1例退出研究），對得到的41個患兒的WES測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，鑒定出2個新致病基因、22個基因的變異新增相關(guān)表型，9個基因的變異的表型與預(yù)期一致，并且其中28個患兒已經(jīng)得到明確診斷，18個患兒已經(jīng)得到了針對性干預(yù)性治療實驗[5]。
圖片來源：The New England Journal of Medicine
一句話點(diǎn)評
一定數(shù)目的患者群+靠譜的WES分析+完整的臨床資料+相關(guān)實驗層面的驗證，輔助新的致病基因的發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)大已知致病基因的表型譜，并且輔助臨床進(jìn)行診斷和針對性的干預(yù)。
二、運(yùn)氣路線：罕見家系
無需大量樣本的累積，只需要單個罕見家系就可以鑒定出新的基因，期待每一位臨床醫(yī)生都能有這樣的運(yùn)氣，下面來看實例：
圖片來源：Journal of Clinical Medicine
上文發(fā)表在《Journal of Clinical Medicine》,IF:5.6。自閉癥譜系障礙（ASD）是一組具有高遺傳性的神經(jīng)發(fā)育障礙，盡管其潛在的遺傳因素仍然沒有研究透徹。作者通過全基因組拷貝數(shù)變異分析和整個外顯子組測序（WES）分析來自撒丁島的兩個ASD兄弟的全面遺傳表征，鑒定與該病癥相關(guān)的新的遺傳改變。單核苷酸多態(tài)性（SNP）陣列數(shù)據(jù)揭示了兄弟姐妹中涉及CAPG，ELMOD3和SH2D6基因的罕見微缺失。WES分析導(dǎo)致在受影響的兄弟姐妹中識別VDAC3中罕見的移碼突變，這是一種不能喪失功能突變的基因，編碼位于PSD上的電壓依賴性陰離子通道。此外，在對PSD蛋白的功能變異編碼喪失的基因中鑒定出四種錯義損傷變體：PLXNA2，KCTD16，ARHGAP21和SLC4A1。該研究將CAPG和VDAC3鑒定為候選基因，并為編碼ASD易感性中PSD蛋白的基因提供額外支持證據(jù)[6]。
一句話點(diǎn)評
罕見自閉癥家系+WES&全基因組拷貝數(shù)分析+基因功能研究，單個家系就能找到新的ASD致病基因。
最后來看一篇2016年發(fā)表在《The New England Journal of Medicine》上的文章，這篇文章堪稱單個家系發(fā)現(xiàn)新的致病基因并進(jìn)行驗證的教科書。
來自中美兩國學(xué)者在新英格蘭雜志上聯(lián)合發(fā)布的一篇關(guān)于發(fā)現(xiàn)阻礙人卵母細(xì)胞分裂的新基因TUBB8。該研究先是對一個患有不孕癥的超大家系中5名家庭成員進(jìn)行全外顯子檢測，包括3名不孕患者。再找到備選基因TUBB8后，對該3名患者及其他家庭成員還有另外23個患病家庭進(jìn)行Sanger驗證。最后通過定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)對TUBB8的表達(dá)及其同型β-微管蛋白在人類卵母細(xì)胞、早期胚胎、精子細(xì)胞和一些體細(xì)胞組織中進(jìn)行表達(dá)量測定。最后得出TUBB8突變體會導(dǎo)致女性不孕[7]。
圖片來源：The New England Journal of Medicine
一句話點(diǎn)評
好的家系經(jīng)WES篩出可疑致病位點(diǎn)，再通過大樣本Sanger驗證后對候選基因進(jìn)行功能驗證實驗，邏輯縝密，毫無破綻，堪稱科研思路模板。
小結(jié)
這里給臨床醫(yī)生總結(jié)了一些科研的小貼士：
1、遇到高度懷疑遺傳導(dǎo)致的疾病，但WES臨床報告顯示為陰性的報告不要?dú)怵H，很可能新的致病基因在萬千variants中等你找到它并驗證它；
2、單個家系直接找到新基因太考驗運(yùn)氣，不如試試多積累些樣本進(jìn)行隊列分析；
3、如果你的樣本在做了WES和CMA（CNV-seq亦可）后仍未發(fā)現(xiàn)有意義的突變，可以嘗試WGS或者三代測序；
4、一些特殊類型的突變，如動態(tài)突變（脆X綜合征）、存在高度同源性的假基因的疾?。ㄏ忍煨阅I上腺皮質(zhì)增生）等，是不適用于NGS測序的，要選擇對應(yīng)的檢測方法才能正確檢出；
5、當(dāng)常規(guī)NGS遇到瓶頸的時候，有可能跟表觀遺傳學(xué)相關(guān)，一些甲基化芯片或者甲基化NGS等也是不錯的選擇；
6、科研需趁早，也許今年20個樣本就能發(fā)3分，到明年想發(fā)3分就要50個樣本了，攢樣復(fù)攢樣，不如分秒必爭多收集相關(guān)疾病樣本進(jìn)行研究。
最后祝各位臨床醫(yī)生投稿必中，中必高分！
參考文獻(xiàn)
[1] 《醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)》鄔玲仟，張學(xué)主編. —北京：人民衛(wèi)生出版社，2016.
[2] Alison M. M., Morad A., David R F., Martin S. T., Variant detection sensitivity and biases in whole genome and exome sequencing.,BMC Bioinfomatics 2014, 15:247.
[3] Cooper DN, Krawczak M, Antonarakis S. In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. 7th edn. 1995:259-291.
[4] Tilghman JM, et al., Molecular Genetic Anatomy and Risk Profile of Hirschsprung’s Disease. N Engl J Med. 2019 Apr 11;380(15):1421-1432. doi: 10.1056/NEJMoa1706594.
[5] Maja Tarailo-Graovac et al., Exome Sequencing and the Management of Neurometabolic Disorders., N Engl J Med. 2016 June 9; 374(23): 2246–2255. doi:10.1056/NEJMoa1515792.
[6] Elena Bacchelli, et al., Analysis of a Sardinian Multiplex Family with Autism Spectrum Disorder Points to Post-Synaptic Density Gene Variants and Identifies CAPG as a Functionally Relevant Candidate Gene., J. Clin. Med. 2019, 8, 212; doi:10.3390/jcm8020212.
[7] Ruizhi Feng, et al., Mutations in TUBB8 and Human Oocyte Meiotic Arrest., N Engl J Med 2016;374:223-32. DOI: 10.1056/NEJMoa1510791.
