01
DNA甲基化修飾的基本概念
遺傳密碼除了ATCG四堿基之外，其中胞嘧啶C也因其嘧啶環(huán)第5倍碳原子的甲基化修飾，而攜帶表觀遺傳信息而被稱為第5位堿基（5-甲基胞嘧啶，5mC）。DNA的甲基化修飾自1948年被發(fā)現(xiàn)以來，一直都是表觀遺傳領(lǐng)域的研究熱點[1]。DNA的甲基化修飾賦予了DNA雙鏈除蛋白質(zhì)編碼信息外的表觀遺傳記憶，對基因組穩(wěn)定性、基因表達(dá)和發(fā)育具有深遠(yuǎn)的影響。[2] PMID: 24439369：Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions. 胞嘧啶的甲基化修飾的酶促機(jī)制人們早已清楚，包括從頭進(jìn)行甲基化修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A等以及維持DNA甲基化的DNMT1等[3]。其中DNMT3A和DNMT3B 建立新的DNA甲基化模式，它們的活性可以由無催化活性的DNMT3L調(diào)節(jié)。DNMT1的功能是維持新合成鏈中的胞嘧啶甲基化修飾，基因組中的回文結(jié)構(gòu)CpG二核苷酸正是DNMT1作用的基礎(chǔ)，所以在基因組中兩條鏈互補(bǔ)的CpG胞嘧啶通常以對稱方式甲基化。除了CpG胞嘧啶的修飾外，非CpG（CpH，H = A，T，C）的甲基化在植物常見，也發(fā)現(xiàn)于哺乳動物的卵母細(xì)胞、多能胚胎干細(xì)胞（ESCs）和成熟神經(jīng)元中（其他體細(xì)胞中雖然很少見但也有分布）[4-6]。
圖 1. DNA甲基轉(zhuǎn)移酶種類與結(jié)構(gòu)
02
5hmC與DNA甲基化的動態(tài)修飾
很長一段時間以來，人們對DNA去甲基化的認(rèn)識還是停留在被動去甲基化（passive demethylation）途徑：即在DNA合成的過程中，新合成的那條鏈?zhǔn)菬o甲基化修飾的，如果DNMT1不能很好的依照舊DNA鏈的甲基化模板，維持新鏈DNA甲基化修飾的話，那么新合成的DNA則失去了甲基化修飾。[7]
圖 2. 哺乳動物中的DNA甲基化的從頭甲基化酶以及被動去甲基化過程示意圖。Dnmt3a和Dnmt3b可將甲基引入未甲基化的DNA中。當(dāng)DNA被復(fù)制時，舊鏈上的甲基被識別，并通過酶Dnmt1在新鏈上引入新的甲基。去甲基化可以在Dnmt1失活的情況下發(fā)生，經(jīng)過多次DNA復(fù)制達(dá)到被動去甲基化的結(jié)果。
被動去甲基化的原理很簡單，但并不能解釋一些生命過程，如配子發(fā)育及早期胚胎發(fā)育過程中的甲基化重塑過程。例如在受精后，受精后，母本來源基因組中的5mC主要通過被動去甲基化而喪失，而父系基因組中的5mC在數(shù)小時內(nèi)迅速喪失，這表明存在全局的主動去甲基化過程[8, 9]。
圖 3 a.生殖細(xì)胞發(fā)育及胚胎發(fā)育過程中的去甲基化與重編程（reprograming）示意圖。b. 胚胎發(fā)育早期甲基化程度動態(tài)變化真實結(jié)果。c. 各去甲基化酶以及甲基化酶在胚胎發(fā)育早期的動態(tài)表達(dá)趨勢。
對于DNA的主動去甲基化的了解，直到2009年DNA的去甲基化酶--DNA雙加氧酶TET的發(fā)現(xiàn)，才標(biāo)志著DNA主動去甲基化研究的真正開始[10]。DNA甲基化修飾的主動去除大體上分為氧化途徑與非氧化途徑，篇幅所限不再贅述，感興趣可詳閱Cell雜志的一篇經(jīng)典綜述[2]。在多種去甲基化途徑中有兩個關(guān)鍵分子：DNA雙加氧酶--TET（ten-eleven translocation）以及胞嘧啶脫氨酶--APOBEC。其中TET可催化5-甲基胞嘧啶（5mC）氧化，生成的第一步氧化產(chǎn)物也就是我們這一系列專題的主角--5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine ,5-hmC)。TET蛋白還可進(jìn)一步氧化5- 羥甲基胞嘧啶為5- 甲酰胞嘧啶（5-formylcytosine，5fC）和5-羧基胞嘧啶 (5-carboxylcytosine,5caC)， 5fC和5caC可被胸腺嘧啶DNA糖基化酶（thymine DNA glycosylase，TDG）特異性識別并切除，從而實現(xiàn)DNA的主動去甲基化。除氧化途徑外，APOBEC1或AID酶對5hmC至5hmU的脫氨作用，隨后進(jìn)行堿基切除修復(fù)（BER）修復(fù)，這是在腦和原始生殖細(xì)胞中潛在的主動去甲基化途徑[2]。TET酶與APOBEC酶不但在DNA的去甲基化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，同時也被利用為甲基化研究的工具酶，將在后續(xù)部分中詳述。
圖 4. 被動及主動去甲基化的過程示意圖
03
5hmC修飾的分布
如圖4中可見，5甲基化胞嘧啶的氧化過程中產(chǎn)生了5hmC以及更進(jìn)一步的氧化產(chǎn)物。一個重要的問題是這些5mC的氧化衍生物是否僅僅是去甲基化過程的中間產(chǎn)物，或者它們本身是否具有功能作用。全基因組測序的方法已經(jīng)生成5hmC堿基修飾在基因組中的分布[11, 12]。這5hmC的修飾水平顯著低于5mC水平：5hmC的水平在不同組織間的比例約在0.05%~0.6%，大多在0.1%左右，而5mC修飾比例約為2.5~3%。5hmC的含量變化不但與細(xì)胞類型有關(guān)，還與基因組的不同結(jié)構(gòu)有關(guān)，在P300及CTCF結(jié)合位點，以及增強(qiáng)子與DNase I超敏位點等調(diào)控區(qū)域中含量最高。這也提示了5hmC并不僅僅是胞嘧啶去甲基化的中間體，而具有特定的功能。
圖 5. 5hmC在不同組織、細(xì)胞以及不同結(jié)構(gòu)區(qū)域中的含量
在人體的各種組織中，大腦的5hmC含量最高，在成年大腦中，13％的所有CpG都是高度羥甲基化的，在基因區(qū)和遠(yuǎn)端調(diào)節(jié)元件中具有強(qiáng)烈富集。在發(fā)育過程中，5hmC的比例在前額葉皮質(zhì)中發(fā)生了很大的改變，在成年個體中檢測到大約2840萬hmCs，比胎兒前額葉皮層高10倍。hmC主要存在于CpG中（成人為97.4％）皮質(zhì)和胎兒皮質(zhì)中的99.86％）[13]
圖 6. 人腦中的5hmC和5mC分布示意圖。（a） CG，CHH和CHG序列中成人或胎兒腦中hmCs或有修飾的胞嘧啶的百分比。（b） hmC，mC和總修飾（hmC + mC）譜的實例。[13]
04
動態(tài)的甲基化修飾-在正確的時間與地點
絢爛多彩生命現(xiàn)象背后是復(fù)雜表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，隨著剝繭抽絲般的研究一步步深入，神秘而奧妙的生命遺傳本質(zhì)的面紗正逐步被揭開。最初啟動子區(qū)的甲基化修飾被廣泛地接受為抑制性表觀遺傳學(xué)修飾，后來更新報道提示了基因本體（gene body）區(qū)域甲基化修飾的轉(zhuǎn)錄激活作用[14]，除此之外，甲基化對基因表達(dá)的調(diào)控可能還涉及5mC和序列特異性的轉(zhuǎn)錄因子（TF）之間的相互作用[15, 16]。
DNA甲基化也曾被認(rèn)為是一種穩(wěn)定的可遺傳的標(biāo)記，而后續(xù)又發(fā)現(xiàn)在正常的發(fā)育、分化以及疾病的發(fā)生發(fā)展中，甲基化在增強(qiáng)子、gene body以及一些調(diào)控元件上會發(fā)生動態(tài)的變化，提示了甲基化修飾在這些過程中的調(diào)控作用[6, 17]。例如，在正常的發(fā)育過程中全基因組的甲基化水平會出現(xiàn)整體的去甲基化；在生殖細(xì)胞著床后的全局甲基化水平增加；在胎兒發(fā)育的晚期的調(diào)節(jié)序列的局部去甲基化；在分化組織中活躍調(diào)節(jié)序列中的去甲基化；在衰老以及腫瘤的發(fā)展過程中也會普遍存在DNA甲基化的變異[18]。
圖 7. 正常的發(fā)育階段中的整體甲基化水平變化；以及發(fā)育、衰老以及腫瘤過程中特定區(qū)域的DNA甲基化變化示意圖。
5hmC，5-fC和5-CaC的發(fā)現(xiàn)將會為帶來了更深入的認(rèn)識。對于DNA甲基化的研究要用動態(tài)的眼光去考察，分析mC與5hmC修飾是如何在正確的時間修飾在正確的地點。此外甲基化修飾并不是孤立的存在，而是與各種相關(guān)蛋白或轉(zhuǎn)錄因子共同作用發(fā)揮功能，所以在研究DNA甲基化修飾的同時，整合的分析組蛋白修飾的變化以及TET、DNMT與MECP2等甲基化相關(guān)蛋白的表達(dá)與結(jié)合位點變化，將幫助我們更全面的認(rèn)識DNA甲基化修飾這一復(fù)雜的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。
圖 8. DNA甲基化在不同基因組結(jié)構(gòu)中的功能和調(diào)控模式示意圖
05
未完待續(xù)
后續(xù)我們重點關(guān)注5hmC的功能以及分析技術(shù)的進(jìn)展和相關(guān)研究的應(yīng)用案例，敬請期待。
圖 9
06
參考文獻(xiàn)
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