溫馨提示：文末論文發(fā)表背后的故事同樣精彩！人活在世界上，基本上每天要做的有四件事：呼吸、睡眠、飲水和進食?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》中說：“躁則消亡，靜則神藏”。睡眠，這個錨定在人類基因中的生理活動，占據(jù)了人類生命總長的三分之一。與睡眠相對應(yīng)的一個詞，失眠，現(xiàn)已成為當(dāng)今社會的流行詞?！笆呤且环N病/視線模糊的眼睛/翻來覆去的地獄/誰帶我逃離這里”。據(jù)流行病學(xué)近年統(tǒng)計，中國目前有超過三億人具有睡眠障礙，成年人失眠發(fā)生率高達38.2%。美國有近7000萬人受到失眠折磨，每年每四個人當(dāng)中就有一個被診斷為失眠癥，需要定期或長期服用鎮(zhèn)靜催眠藥物。正因為有如此龐大的受眾群體，鎮(zhèn)靜催眠藥物的開發(fā)力度持久綿長。僅安定（Diazepam, 商用名Valium，苯二氮卓類）一種目前市場上就有超過500個品牌。因此對鎮(zhèn)靜催眠藥物的機制研究和開發(fā)一直是科學(xué)界的研究熱點。McCarthy, K. (2017, August 28). Confessions Of An Insomniac. Retrieved from https://www.t heodysseyonline.com/self-diagnosed-insomniac .GABAA受體（-氨基丁酸A型受體）是一種由五個亞基組成的配體門控離子通道受體。其內(nèi)源性配體是一種被稱為GABA（-氨基丁酸）的神經(jīng)遞質(zhì)，GABA是脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。GABAA受體的活性位點和異構(gòu)調(diào)節(jié)位點是多種抗焦慮、失眠和麻醉藥物，例如苯二氮卓類、巴比妥類、乙醇、神經(jīng)災(zāi)體以及吸入性麻醉劑等的作用靶點。GABAA受體與GABA結(jié)合后能夠快速開放Cl-通道介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)快速抑制性突觸傳遞。突觸是指一個神經(jīng)元的沖動傳到另一個神經(jīng)元或傳到另一細胞間的相互接觸的結(jié)構(gòu)。突觸上GABAA受體的數(shù)量、分布和動力學(xué)性質(zhì)的改變是調(diào)節(jié)抑制性突觸傳遞強度和神經(jīng)環(huán)路信息處理的關(guān)鍵機制。而GABAA受體的相關(guān)功能的改變與調(diào)節(jié)（突觸受體數(shù)量、分布和動力學(xué)性質(zhì)的改變）到底是自發(fā)性的還是受到某些未知附著蛋白的調(diào)控還不得而知。而針對這些問題的研究對于理解中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)突觸抑制性調(diào)控和鎮(zhèn)靜催眠藥物的作用機制是十分重要的。2019年10月11日，美國國立衛(wèi)生研究院貝塞斯達總部陸偉團隊在Science雜志上發(fā)表了題為Shisa7 is a GABAA receptor auxiliary subunit controlling Benzodiazepine actions的研究。這項工作首次發(fā)現(xiàn)一種單跨膜蛋白 (Single-pass transmembrane protein) Shisa7作為GABAA受體的輔助亞基能夠調(diào)節(jié)GABAA受體的運輸、功能和鎮(zhèn)靜催眠藥物的藥理作用。“Han et al., investigated if a protein called Shisa7 was involved in regulating GABAA receptor expression and function…Shisa7 was found at GABA-releasing synapses, where it interacted with GABAA receptors, controlled receptor concentration at the synapse, sped up receptor expression, gating kinetics, and pharmacology of GABAA receptors in the brain.”——Science, Peter Stern (Senior editor)隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，研究人員對GABAA受體關(guān)聯(lián)蛋白尤其是突觸相關(guān)蛋白之間的功能相關(guān)性研究越來越感興趣。通過對AMPA受體（離子型谷氨酸受體，與GABAA受體功能相反，介導(dǎo)快速興奮性突觸傳遞）輔助亞基（Auxiliary subunit）的系統(tǒng)性研究之后，確定了輔助亞基的存在價值和重要意義。因此也總結(jié)出離子型通道受體的輔助亞基的功能特點：1）在細胞表面可以與離子型受體形成穩(wěn)定的復(fù)合物；2）能夠調(diào)節(jié)離子型受體的功能（突觸后電流以及動力學(xué)性質(zhì)等功能）；3）調(diào)節(jié)離子型受體在細胞表面的運輸?shù)?/span>【1】。近幾年來，幾個實驗團隊分別針對跨膜蛋白LHFPL4/GARLH4【2-4】和Clptm1【5】發(fā)表了關(guān)于這兩種蛋白對GABAA受體調(diào)節(jié)的研究論文。這些文章打破了一直以來人們對GABAA受體的認(rèn)知局限，闡述了這兩種新跨膜蛋白對GABAA受體的調(diào)節(jié)作用。但遺憾的是，人們未能發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白改變GABAA受體動力學(xué)性質(zhì)，也沒有發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白參與GABAA受體相關(guān)的藥理作用，這意味著可能有其他跨膜蛋白與GABAA受體形成復(fù)合體并能夠調(diào)節(jié)GABAA受體動力學(xué)性質(zhì)。2004年，日本學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)節(jié)蛙類頭部形成的基因，并以日本南部神話雕像命名該基因為Shisa，意為守護者。Kanpai. (2015, November 30). Shisa: The Guardian Lions of Okinawa. Retrieved from https://www.kanpai-japan.com/lifestyle/shisa-okinawa .Shisa7是一種單跨膜蛋白，屬于Shisa家族，該蛋白家族結(jié)構(gòu)特點是都具有胞外區(qū)域富含胱氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu) (cystine-rich repeat region) 以及胞內(nèi)尾端的盤狀同源區(qū)域配體（PDZ motif）。在本文中，研究者通過對Shisa7在抑制性突觸后共定位、GABAA受體相關(guān)電生理性質(zhì)和動力學(xué)性質(zhì)的調(diào)節(jié)作用以及對GABAA受體細胞表面的運輸?shù)妊芯渴状伟l(fā)現(xiàn)Shisa7是一種GABAA受體的輔助亞基，并且Shisa7的缺失能夠顯著降低Diazepam的鎮(zhèn)靜,抗焦慮和催眠等的藥理作用。前期研究表明，Shisa蛋白家族與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)另外一種重要的離子通道受體AMPA受體具有相關(guān)性【6】。與GABAA受體功能相反，AMPA受體能夠介導(dǎo)哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)快速興奮性突觸傳遞。已有文章顯示該家族成員Shisa6和Shisa9是AMPA受體的輔助亞基。有趣的是，在探索Shisa家族與AMPA受體相關(guān)性研究過程中，人們發(fā)現(xiàn)Shisa7作為該家族成員家族蛋白在異源細胞中并沒有明顯調(diào)節(jié)AMPA受體相關(guān)功能的作用【6】。我們因此提出一種可能性假設(shè)，Shisa7可能具有與其它家族成員不同的功能，其有可能參與非AMPA受體的功能性調(diào)控作用。為了驗證該假設(shè)，陸偉團隊的韓文妍博士與李軍博士一起應(yīng)用免疫細胞化學(xué)方法檢測了Shisa家族蛋白在海馬神經(jīng)元中的亞細胞分布，并應(yīng)用AiryScan超分辨率顯微技術(shù)和STED（受激發(fā)射損耗熒光顯微技術(shù), 這是同Ling-Gang Wu團隊的Lihao Ge博士的合作）證明了不同于其他Shisa家族蛋白（Shisa6和Shisa9）與興奮性突觸蛋白標(biāo)志物共定位，內(nèi)源性Shisa7蛋白主要與抑制性突觸后蛋白標(biāo)志物 (Gephyrin和vGAT) 以及GABAA受體亞基共定位。之后韓文妍博士進一步應(yīng)用CRISPR-CAS9技術(shù)結(jié)合子宮內(nèi)電穿孔技術(shù) （In utero electroporation）在小鼠海馬CA1區(qū)域椎體神經(jīng)元內(nèi)（pyramidal neuron）單細胞基因敲除Shisa7。單細胞敲除Shisa7導(dǎo)致在急性海馬腦片內(nèi)引起小抑制性突觸后電流（miniature inhibitory postsynaptic current, mIPSC）頻率降低，而且這種現(xiàn)象在基因敲除小鼠身上也同樣發(fā)生。在應(yīng)用雙全細胞膜片鉗記錄（dual whole-cell recording）中也發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，單細胞基因敲除Shisa7能夠顯著降低急性海馬腦片內(nèi)刺激引發(fā)的抑制性突觸后電流（evoked IPSC）說明Shisa7在保持抑制性突出后電流正常輸出中具有重要作用。這些發(fā)現(xiàn)包括Shisa7存在于抑制性突觸后并能夠調(diào)節(jié)突觸后電流的輸出，促使研究者又通過使用共免疫沉淀法發(fā)現(xiàn)在異源細胞內(nèi)Shisa7和單獨GABAA受體1，2和2亞基具有相互作用。在小鼠腦海馬組織內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了這些蛋白之間的相互作用。研究者還通過交互變異克隆手法確定了在Shisa7胞外N端存在一段不保守區(qū)域（N154-175-Shisa7）, 這段不保守區(qū)域被鑒定為Shisa7與GABAA受體的結(jié)合區(qū)域，命名為GRID (the GABAAR interacting domain) 。過表達的Shisa家族蛋白在海馬神經(jīng)元中的亞細胞分布通過對Shisa7基因敲除小鼠海馬組織突觸體內(nèi)GABAA受體相關(guān)蛋白表達的研究，研究者還發(fā)現(xiàn)敲除Shisa7能夠顯著引起突觸體內(nèi)多種GABAA受體亞基蛋白表達量下調(diào)。不僅如此，陸偉團隊韓文妍博士和Jun Li博士以及NIH/NIDCD的Ronald S. Petralia博士和Ya-Xian Wang女士還利用蛋白免疫熒光染色法和免疫金電鏡法考察了對照組和Shisa7基因敲除組突觸內(nèi)GABAA受體亞基蛋白表達水平。結(jié)果顯示，Shisa7基因敲除組中突觸體內(nèi)GABAA受體亞基1和2蛋白表達水平顯著降低，以上結(jié)果說明Shisa7參與調(diào)節(jié)GABAA受體在細胞表面的運輸和調(diào)控抑制性突觸傳遞強度。確定一個蛋白是否是離子型受體的輔助亞基的關(guān)鍵在于其是否對該離子型受體的脫敏和失活等動力學(xué)特性有影響。研究結(jié)果表明，Shisa7與GABAA受體形成復(fù)合物后能夠改變GABAA受體的動力學(xué)特性，最終改變通過GABAA受體進入到細胞和突觸的總電荷數(shù)。通過以上結(jié)果研究人員初步描繪了Shisa7作為GABAA受體輔助亞基的功能框架，發(fā)現(xiàn)原來GABAA受體并不是獨立的存在，在它的周圍結(jié)合著一些輔助蛋白能夠幫助和平衡GABAA受體在細胞表面的正常表達和行使功能，并進而調(diào)控抑制性突觸傳遞強度和神經(jīng)環(huán)路信息處理等功能作用。那么到底Shisa7是否參與跟GABAA受體相關(guān)的藥理作用呢？Wenyan Han博士通過應(yīng)用GABA介導(dǎo)的全細胞電流膜片鉗方法考察了一系列相關(guān)蛋白在Diazepam引起的電流增強作用中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這些蛋白中（包括前文提到的LHFPL4/GARLH4），只有Shisa7能夠改變Diazepam引起的電流增強作用。在這之后，Wei Lu團隊進行了一系列Diazepam相關(guān)行為學(xué)實驗，確定了在Shisa7敲除小鼠中Diazepam的鎮(zhèn)靜、抗焦慮和催眠等藥理作用顯著減弱。這些發(fā)現(xiàn)闡明了Shisa7作為GABAA受體輔助亞基參與鎮(zhèn)靜催眠藥物的藥理作用，為臨床藥物開發(fā)和基因治療提供了重要的臨床前數(shù)據(jù)。在課題進行期間，我們面臨的最大挑戰(zhàn)和局限就是對內(nèi)源跨膜蛋白的位置確定問題。由于跨膜蛋白的特殊性，導(dǎo)致一時之間無法從市面上購買到滿意的抗體，即使自己做抗體也是成敗幾率對半。Shisa7就是一個很好的例子。我們首先針對Shisa7胞內(nèi)一段結(jié)構(gòu)設(shè)計了多克隆抗體，免疫印記活性雖然良好，但遺憾的是，由于Shisa7蛋白具有復(fù)雜的糖基化和其他未知的三維結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致該抗體非特異性條帶較多且無法用于免疫熒光實驗。之后我們又試圖利用CRISPR-CAS9基因敲入技術(shù)在Shisa7的胞外起始端插入一個3xFlag標(biāo)記物。標(biāo)記物的插入雖然成功，但可能是由于Shisa7胞外結(jié)構(gòu)的高度不穩(wěn)定和不確定性引起了轉(zhuǎn)基因小鼠的一系列原因不明的異常改變，例如雜合子雄性小鼠生殖器容易感染進而無法授精導(dǎo)致繁育率極低；轉(zhuǎn)基因小鼠里的Shisa7蛋白表達只有野生型小鼠的一半并且?guī)в袠?biāo)記物的Shisa7蛋白表達更低，這導(dǎo)致即使在純合子的原代神經(jīng)元內(nèi)的熒光強度十分微弱，沒辦法清晰定位神經(jīng)元內(nèi)源Shisa7。折騰、彷徨和糾結(jié)了近1年左右，最終只有無奈接受轉(zhuǎn)基因敲入小鼠的開發(fā)失敗。但幸運的是，最后我們與GenScript生物公司合作開發(fā)了單克隆抗體，在經(jīng)過篩選近100個單克隆抗體樣本后，終于獲得了一個能夠應(yīng)用于免疫熒光實驗的單克隆抗體。在課題進行期間，得到實驗室里分子神經(jīng)生物學(xué)博士Jun Li的大力幫助，我們共同經(jīng)歷了很多實驗瓶頸。在經(jīng)過無數(shù)次的討論我們最終解決了諸多免疫熒光技術(shù)上的難題。在2017年圣誕節(jié)前，荷蘭一課題組率先發(fā)表了一篇關(guān)于Shisa7和AMPA受體相關(guān)性的文章【7】，其觀點結(jié)論與我們的初始觀察到的實驗現(xiàn)象有所不同。這對于當(dāng)時還處于課題中期的我來說是一種意外也是一種挑戰(zhàn)。在這之后，我雖然經(jīng)常性失眠，以及壓力性肥胖（嗯，我就是這么安慰自己的，并不是我吃得多……），但探索真相的原始驅(qū)動力促使我們不斷完善實驗思路和實驗設(shè)計。可能壓力就是動力，這篇文章一直鞭策我們多轉(zhuǎn)換思考問題的角度，多驗證數(shù)據(jù)的可靠性還有多獲得不同的角度的具有關(guān)鍵意義的數(shù)據(jù)去完善和證明我們的觀察和假說。經(jīng)過團隊3年的努力與堅持，在陸偉博士的鼓勵下，我們將這項工作投到Science雜志。也許是被幸運之神眷顧，我們的工作得到全體審稿人的一致高度評價，最終從投稿到被Science雜志接受只用了4個半月的時間。我是Jun Li，很高興親身經(jīng)歷這樣一個令人興奮的時刻，作為這項課題的全程親歷者，回顧整個研究過程中經(jīng)歷的點點滴滴和各個難關(guān)，心中難免感慨萬千！說起Shisa7 這個課題，要追溯到2016年早期，當(dāng)時我和Wei Lu 博士進行最新文獻的常規(guī)跟蹤檢索時注意到了一些關(guān)于Shisa家族蛋白有意思的現(xiàn)象。出于科研上的經(jīng)歷和洞察力，Wei發(fā)現(xiàn)Shisa7是個十分有趣的蛋白，它與其他同家族蛋白的功能看起來并不一致。這是個非常有意思的線索，值得進一步研究！得益于Wei的決斷力和執(zhí)行力，我們迅速開始了Shisa7初步質(zhì)粒構(gòu)建的準(zhǔn)備，沒多久我便和兩名實習(xí)生一起著手構(gòu)建了Shisa7的表達載體質(zhì)粒。但由于我當(dāng)時正忙于另外一項課題的最后沖刺階段【8】，Shisa7課題之后就交給了當(dāng)年剛加入實驗室的Wenyan Han博士。我在之后參與其中突觸蛋白共定位和細胞表面受體蛋白運輸?shù)拿庖邿晒鈱嶒灩ぷ鳌?/span>由于Wenyan對電生理膜片鉗技術(shù)的濃厚興趣，加上她之前的藥理學(xué)教育背景和豐富的動物行為學(xué)分析經(jīng)驗，同時在Wei的有力指導(dǎo)和多個合作者的通力配合下，克服重重困難，使得Shisa7 這個課題能夠穩(wěn)打穩(wěn)扎快速向前推進，最終得以在Science上正式發(fā)表。同時Wei Lu 實驗室目前課題豐富前沿，經(jīng)費充足，實驗室儀器設(shè)備先進完備，誠招相關(guān)專業(yè)博士后人員1-2名，具體信息請發(fā)送郵件至：luw4@mail.nih.gov 或前往實驗室網(wǎng)站查詢：https://sites.google.com/site/lulaboratorynih/position-1?authuser=0http://science.sciencemag.org/content/366/6462/2461. Jackson AC, Nicoll RA. The expanding social network of ionotropic glutamate receptors: TARPs and other transmembrane auxiliary subunits. Neurone, 2012, PMID: 21521608.
2. Yamasaki T, Hoyos-Ramirez E, Martenson JS, Morimota-Tomita M, Tomita S. GARLH family proteins stabilize GABAAreceptors at synapses. Neuron, 2017, PMID: 28279354.
3. Wu M, Tian HL, Liu X, Lai JHC, Du S, Xia J. Impairment of Inhibitory Synapse Formation and Motor Behavior in Mice Lacking the NL2 Binding Partner LHFPL4/GARLH4.Cell Rep, 2018, PMID:29742426.
4. Davenport EC, Pendolino V, Kontou G, McGee TP, Sheehan DF, López-Doménech G, Farrant M, Kittler JT. An Essential Role for the Tetraspanin LHFPL4 in the Cell-Type-Specific Targeting and Clustering of Synaptic GABAA Receptors. Cell Rep, 2017, PMID:28978485.
5. Ge Y, Kang Y, Cassidy RM, Moon KM, Lewis R, Wong ROL, Foster LJ, Craig AM. Clptm1 Limits Forward Trafficking of GABAA Receptors to Scale Inhibitory Synaptic Strength. Neuron, 2018, PMID: 29395912.
6. Farrow P, Khodosevich K, Sapir Y, Schulmann A, Aslam M, Stern-Bach Y, Monyer H, von Engelhardt J. Auxiliary subunits of the CKAMP family differentially modulate AMPA receptor properties. eLife. 2015, PMID:26623514.
7. Schmitz LJM, Klaassen RV, Ruiperez-Alonso M, Zamri AE, Stroeder J, Rao-Ruiz P, Lodder JC, van der Loo RJ, Mansvelder HD, Smit AB, Spijker S. The AMPA receptor-associated protein Shisa7 regulates hippocampal synaptic function and contextual memory. eLife. 2017, PMID:29199957.
8. Li J, Han W, Pelkey KA, Duan J, Mao X, Wang YX, Craig MT, Dong L, Petralia RS, McBain CJ, Lu W. Molecular Dissection of Neuroligin 2 and Slitrk3 Reveals an Essential Framework for GABAergic Synapse Development. Neuron. 2017, PMID: 29107521
