一、微生物工業(yè)對(duì)菌種的要求

(一)、微生物工業(yè)的生產(chǎn)水平由三個(gè)要素決定：生產(chǎn)菌種的性能、發(fā)酵及提純工藝條件、生產(chǎn)設(shè)備。其中生產(chǎn)菌種的性能是最重要的因素。

（二）、微生物工業(yè)對(duì)菌種的要求是：

（1）菌株高產(chǎn)，在較短的時(shí)間內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)生大量發(fā)酵產(chǎn)物的能力;

（2）在發(fā)酵過程中不產(chǎn)生或少產(chǎn)生與目標(biāo)產(chǎn)品相近的副產(chǎn)品及其他產(chǎn)物;

（3）生長(zhǎng)繁殖能力強(qiáng)，較強(qiáng)的生長(zhǎng)速率，產(chǎn)孢子的菌種應(yīng)該具有較強(qiáng)的產(chǎn)孢子能力;

（4）能夠高效地將原理轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品;

（5）能利用廣泛的原材料，并對(duì)發(fā)酵原料成分的波動(dòng)敏感性小;

（6）對(duì)需要添加的前體物質(zhì)有耐受能力，并且不能將這些前體物質(zhì)作為一般碳源利用;

（7）在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的泡沫要少;

（8）具有抗噬菌體的能力；

（9）遺傳穩(wěn)定性，

 

二、工業(yè)用微生物菌種的來源及選育

（一）微生物菌種的來源

一般通過以下幾個(gè)途徑收集菌種、采集樣品和分離篩選：

（1）是根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；

（2）從大自然中采集樣品分離；

（3）從一些發(fā)酵制品中分離篩選目的菌株。

當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)所用菌種總趨勢(shì)是從野生菌轉(zhuǎn)向變異菌，自然選用轉(zhuǎn)向代謝育種，從誘發(fā)基因突變轉(zhuǎn)向基因重組的定向育種。

（二）微生物工業(yè)菌種的分離

1、野生菌株的分離、篩選過程

（1）新菌種分離與篩選的步驟

菌種分離的流程如下：

標(biāo)本采集 →標(biāo)本材料的預(yù)處理→富集培養(yǎng)→菌種初篩→ 菌種復(fù)篩→性能鑒定→ 菌種保藏

①采樣

采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。

采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時(shí)分離。

②標(biāo)本預(yù)處理

④純種分離：采用劃線分離法、稀釋分離法等純化方法獲取單菌落。

⑤高產(chǎn)菌株的篩選：這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn)，獲得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。還要對(duì)菌種進(jìn)行發(fā)酵性能測(cè)定，

⑥毒性試驗(yàn)：據(jù)有的國家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗(yàn)外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗(yàn)。

 

2、菌種的分離方法

（1）施加選擇性壓力分離法

主要是利用不同種類的微生物其生長(zhǎng)繁殖對(duì)環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)的要求不同，如溫度、pH、滲透壓、氧氣、碳源、氮源等，人為控制這些條件，使之利于某類或某種微生物生長(zhǎng)，而不利于其他種類微生物的生存，以達(dá)到使目的菌種占優(yōu)勢(shì)．而得以快速分離純化的目的。如可以控制培養(yǎng)時(shí)的氧，可將好氧微生物和厭氧微生物分開；通過控制溫度，可將嗜熱微生物和非嗜熱微生物分開；控制pH，可將嗜酸、嗜堿微生物分離等。在分離培養(yǎng)基中也可以加入不同的抗生素或試劑來增加選擇性。如在分離放線菌和細(xì)菌時(shí)，可加入抗真菌抗生素；分離真菌時(shí)，可加入抗細(xì)菌藥物。

（2）隨機(jī)分離方法

有些微生物的產(chǎn)物對(duì)篩選沒有直接的選擇性指示作用，因此常采用隨機(jī)分離方法分離。

A、抗生素產(chǎn)生菌的分離

抗生素產(chǎn)生菌的分離常用抑菌圈法。實(shí)驗(yàn)必須用工具菌：采用抗生素的敏感菌，傳統(tǒng)上常用金黃色葡萄球菌和枯草桿菌。

Ｂ、抗腫瘤藥物產(chǎn)生菌的分離

抗腫瘤藥物產(chǎn)生菌的分離常用方法：生化誘導(dǎo)法、SOS生色檢測(cè)法、DNA修復(fù)能力突變株。原理是利用DNA的損傷，微生物發(fā)生突變。

B1、生化誘導(dǎo)法：將大腸桿菌的lacZ基因連接在λ噬菌體的PL啟動(dòng)子下，當(dāng)DNA損傷時(shí)，誘發(fā)λ阻遏物CI分解，PL啟動(dòng)子啟動(dòng)lacZ基因轉(zhuǎn)錄，測(cè)定表達(dá)的ß-半乳糖苷酶活性，來檢測(cè)藥物的存在。

B2、SOS生色檢測(cè)法：利用當(dāng)DNA損傷時(shí)，可活化yecA蛋白，進(jìn)而分解噬菌體的阻遏蛋白，再引起sifA基因啟動(dòng)lacZ基因轉(zhuǎn)錄，測(cè)定表達(dá)的ß-半乳糖苷酶活性，來檢測(cè)藥物的存在。

Ｃ、生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌的分離

以氨基酸產(chǎn)生菌為例，介紹篩選方法。首先將待試菌接入加了抗真菌的化合物（如亞胺環(huán)己酮）的分離培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，然后采用影印法，將菌落復(fù)印到能支持氨基酸產(chǎn)生菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2-3天后，用紫外線殺司長(zhǎng)好的菌落，再往此平板上面鋪一層相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株菌懸液，培養(yǎng)16小時(shí)后，被殺死的氨基酸產(chǎn)生菌的菌落周圍應(yīng)有一檢測(cè)菌的生長(zhǎng)圈。

（3）目的微生物分離

A、根據(jù)形態(tài)篩選突變株

B、根據(jù)平板菌落生化反應(yīng)篩選變株

透明圈法、呈色圈法、抑菌圈法、渾濁圈法等。

①透明圈法：在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物，使培養(yǎng)基混濁。能分解底物的微生物便會(huì)在菌落周圍產(chǎn)生透明圈，圈的大小初步反應(yīng)該菌株利用底物的能力。該法在分離水解酶產(chǎn)生菌時(shí)采用較多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶產(chǎn)生菌都會(huì)在含有底物的選擇性培養(yǎng)基平板上形成肉眼可見的透明圈。

 

在分離某種產(chǎn)生有機(jī)酸的菌株時(shí)，也通常采用透明圈法進(jìn)行初篩。在選擇性培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，使平板成混狀，將樣品懸浮液涂抹到平板上進(jìn)行培養(yǎng)，由于產(chǎn)生菌能夠把菌落周圍的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈，可以輕易地鑒別出來。分離乳酸產(chǎn)生菌時(shí)，由于乳酸是一種較強(qiáng)的有機(jī)酸，因此，在培養(yǎng)基中加入的碳酸鈣不僅有鑒別作用，還有酸中和作用。

 

②變色圈法：對(duì)于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，可在底物平板中加入指示劑或顯色劑，使所需微生物能被快速鑒別出來。如篩選果膠酶產(chǎn)生菌時(shí)，用含0.2%果膠為惟一碳源的培養(yǎng)基平板，對(duì)含微生物樣品進(jìn)行分離，待菌落長(zhǎng)成后，加入0.2%剛果紅溶液染色4h，具有分解果膠能力的菌落周圍便會(huì)出現(xiàn)絳紅色水解圈。在分離谷氨酸產(chǎn)生菌時(shí)，可在培養(yǎng)基中加入溴百里酚藍(lán)，它是一種酸堿指示劑，變色范圍在pH6.2～7.6，當(dāng)pH在6.2以下時(shí)為黃色，pH7.6以上為藍(lán)色。若平板上出現(xiàn)產(chǎn)酸菌，其菌落周圍會(huì)變成黃色，可以從這些產(chǎn)酸菌中篩選谷氨酸產(chǎn)生菌。

 

③生長(zhǎng)圈法：生長(zhǎng)圈法通常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產(chǎn)生菌。工具菌是一些相對(duì)應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。將待檢菌涂布于含高濃度的工具菌并缺少所需營(yíng)養(yǎng)物的平板上進(jìn)行培養(yǎng)，若某菌株能合成平板所需的營(yíng)養(yǎng)物，在該菌株的菌落周圍便會(huì)形成一個(gè)混濁的生長(zhǎng)圈。如嘌呤營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸桿菌（如E.coliP264）與不含嘌呤的瓊脂混合倒平板，在其上涂布含菌樣品保溫培養(yǎng)，周圍出現(xiàn)生長(zhǎng)圈的菌落即為嘌呤產(chǎn)生菌。

 

④抑菌圈法：常用于抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選，工具菌采用抗生素的敏感菌。若被檢菌能分泌某些抑制菌生長(zhǎng)的物質(zhì)，如抗生素等，便會(huì)在該菌落周圍形成工具菌不能生長(zhǎng)的抑菌圈，很容易被鑒別出來。