在化學發(fā)光印跡中，獲得的信號是可變的，通常被認為是半定量的。然而，在熒光印跡中獲得的信號是與熒光團結合的抗體復合物中靶蛋白的豐度成正比的靜態(tài)值。下表列出了化學發(fā)光和熒光蛋白印跡之間的主要差異。
化學發(fā)光檢測熒光檢測
工作原理酶標二抗 (e.g. HRP 或AP)熒光二抗
檢測方法膜曝光（常見）
數(shù)字成像（少見）
數(shù)字成像
（激光掃描成像儀）
Multiplexing CapabilityNoYes
敏感性++++++
信號穩(wěn)定性幾個小時幾周到幾個月
線性動態(tài)范圍15倍(薄膜檢測)
3,000-4,000倍(數(shù)字成像儀)
>4,000倍
定量檢測酶信號可變，半定量熒光信號是靜態(tài)的,定量
底物Luminol不需底物
如上表所示，熒光蛋白印跡法使用用熒光團標記的二抗。只有當適當波長的光激發(fā)時，熒光團才會發(fā)光。因此，熒光印跡在重復實驗中提供了定量和一致的結果。然而，可見熒光區(qū)域中相當大的膜自發(fā)熒光通常導致較低的信噪比。
此外，通常用于熒光信號檢測的電荷耦合器件（CCD）照相機不能放大弱信號以檢測低表達的蛋白質。這兩個問題可能會限制熒光蛋白印跡的使用。
幸運的是，通過使用具有近紅外（IR）染料的雙色檢測系統(tǒng)，克服了熒光蛋白印跡中缺乏敏感性的缺點。由于紅外區(qū)域的背景熒光較低，紅外熒光蛋白質印跡比使用可見熒光團的方案提供高達200倍的靈敏度。如下所述，這種增加的靈敏度提供了超過化學發(fā)光的蛋白質印跡的許多重要優(yōu)點。
紅外熒光蛋白印跡的優(yōu)點
1.比化學發(fā)光更靈敏
紅外熒光印跡已被證明比化學發(fā)光印跡更敏感. 這是因為IR區(qū)域膜上的低背景熒光產生高的信噪比。配備有光電倍增管（PMT）的激光掃描成像儀對印跡進行成像，并可以將弱信號放大幾個數(shù)量級
2.通過復用提高量化精度
使用雙色檢測方法可以同時檢測相同印跡上的兩種抗原。例如，您可以分析您感興趣的蛋白，并利用內參蛋白（例如GAPDH，肌動蛋白）將其均一化，而無需剝離/重新檢測印跡或運行單獨的凝膠。因此，您的量化將更準確。
3.廣泛的線性動態(tài)范圍用于定量測量
為了確保可靠的定量測量，您從western blot獲得的信號必須在線性動態(tài)范圍內。這意味著信號強度與目標蛋白質豐度呈線性相關。換句話說，信號強度的兩倍增加意味著目標蛋白質水平增加了兩倍。通過激光成像儀獲得的靜態(tài)熒光值是定量的。這是因為熒光強度與幾個數(shù)量級的蛋白質豐度成正比.這提供了廣泛的線性范圍。您可以在相同設置下量化低豐度和高豐度蛋白質，而不用擔心信號飽和或超出線性范圍。
相比之下，X射線膠片的動力學酶 - 底物反應和信號飽和將化學發(fā)光檢測的線性度限制在更小的范圍內。您經(jīng)常需要嘗試各種曝光以獲得差異表達蛋白質的“正確圖像”。這是為了確保捕獲的信號在線性范圍內.
4.一致性和可重復性
熒光信號是僅取決于目標抗原的量的靜態(tài)值，而許多變量影響通過膜曝光獲得的化學發(fā)光信號。一些變量（例如，酶底物反應）難以控制導致不一致和不可重復的結果。 Schutz-geschwender等（2004）報道了熒光蛋白印跡實驗重復的標準偏差遠遠小于化學發(fā)光檢測。因此，為了確保您的免疫印跡結果的重復性和準確性。
5.擴展信號持續(xù)時間
熒光信號非常穩(wěn)定。您可以將您的印跡存儲在冰箱中，并在您準備好后再進行成像。相比之下，如果您正在進行化學發(fā)光的免疫印跡，您通常需要馬上開始成像。這是為了避免酶活性降低。
期刊編輯和評論者越來越普遍要求定量的免疫印跡數(shù)據(jù)。另外，迫切需要提高科學界的蛋白質印跡重現(xiàn)性。正如本文中概述的，IR熒光法相對于化學發(fā)光的方法有許多優(yōu)點。它不僅可以節(jié)省您的時間，而且還為您提供高品質，可發(fā)布和翔實的結果。還在躊躇猶豫，您不妨從使用如下產品開始，開啟您的熒光免疫印跡之旅！
貨號名稱產品鏈接
A23710Dylight 680, Goat Anti-Mouse IgG
詳情A23720Dylight 680, Goat Anti-Rabbit IgG
詳情A23910Dylight 800, Goat Anti-Mouse IgG
詳情A23920Dylight 800, Goat Anti-Rabbit IgG
詳情
