圖1. 新型冠狀病毒
圖片來(lái)源：https://www.cdc.gov/media/dpk/diseases-and-conditions/coronavirus/coronavirus-2020.html
這段日子我們每個(gè)人都在密切關(guān)注著新冠病毒肺炎的疫情。與2003年的非典時(shí)期相比，今天我們所處環(huán)境的最大不同除了微信的廣泛使用外，還有生物醫(yī)學(xué)技術(shù)在過(guò)去17年間的不斷進(jìn)步，我們因此擁有了一些對(duì)付新冠病毒的潛在的新式武器。這些創(chuàng)新的一個(gè)共同優(yōu)勢(shì)是開(kāi)發(fā)周期短，可迅速量產(chǎn)，比傳統(tǒng)手段更適合于應(yīng)對(duì)新發(fā)傳染性疾病。只是，要把這些創(chuàng)新具體地應(yīng)用到控制新冠病毒肺炎上需要時(shí)間，需要醫(yī)藥界的投入，更需要政府、社會(huì)、公益組織的大力支持。在此讓我們簡(jiǎn)單探討一下近幾年來(lái)涌現(xiàn)的幾個(gè)生物醫(yī)藥創(chuàng)新技術(shù)。
預(yù)防: mRNA疫苗
2020年1月23日，美國(guó)Moderna公司宣布將開(kāi)發(fā)針對(duì)新型冠狀病毒（2019-nCoV）的mRNA疫苗。該項(xiàng)目由流行病防范創(chuàng)新聯(lián)盟（CEPI） 資助，合作方還包括美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）。
Moderna以專(zhuān)注開(kāi)發(fā)mRNA藥而聞名，而其藥物管線中技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)最低的幾個(gè)項(xiàng)目就是mRNA預(yù)防性疫苗。這幾個(gè)項(xiàng)目又分為兩大類(lèi)：第一類(lèi)是有商業(yè)前景的感染預(yù)防項(xiàng)目，針對(duì)巨細(xì)胞病毒（CMV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、人類(lèi)偏肺病毒（hMPV）和3型副流感病毒（PIV3）等；第二類(lèi)是帶有公益性質(zhì)的新發(fā)瘟疫項(xiàng)目，針對(duì)塞卡病毒（ZIKV）、流感病毒（H7N9型和H10N8型）和基孔肯雅病毒（CHIKV）等。
讓我們以CMV疫苗項(xiàng)目為例，來(lái)具體看一下Moderna的mRNA疫苗技術(shù)。CMV通過(guò)其病毒顆粒表面的gB蛋白和五聚體蛋白復(fù)合體感染人的成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。Moderna團(tuán)隊(duì)把表達(dá)這6種病毒表面蛋白（gB和形成五聚體的5種蛋白）的6種mRNA分子一起包裝進(jìn)一個(gè)脂質(zhì)納米顆粒（LNP）中，再以LNP為載體將其遞送進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞中。這6種mRNA分子在細(xì)胞內(nèi)與核糖體結(jié)合，翻譯出6種蛋白抗原。這些蛋白再被運(yùn)送到細(xì)胞表面，組裝成gB和五聚體。這樣，內(nèi)吞了外源mRNA的細(xì)胞就“偽裝”成被CMV病毒感染了的細(xì)胞，激活免疫系統(tǒng)，使人體獲得了對(duì)CMV的免疫力。
與其它形式的疫苗（滅活或弱化病毒、蛋白、DNA）相比，mRNA疫苗具有以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：
1） 一次接種可以使人體獲得更強(qiáng)大更持久的定向免疫力；
2） 抗原的設(shè)計(jì)可以更準(zhǔn)確更靈活；
3） 可以表達(dá)幾乎任何膜蛋白、可溶的或多聚體蛋白抗原；
4） 生產(chǎn)mRNA疫苗不需要培養(yǎng)病原體；
5） 可以迅速批量生產(chǎn)；
6） 可以采取靈活的庫(kù)存方法，包括冷凍質(zhì)粒文庫(kù)和未劑型化的mRNA，以應(yīng)對(duì)將來(lái)的瘟疫威脅；
7） 平臺(tái)一旦建立，針對(duì)任何新發(fā)感染病的疫苗可以迅速開(kāi)發(fā)出來(lái)。
然而，Moderna在建立mRNA藥物平臺(tái)時(shí)要克服許多技術(shù)障礙：
首先，mRNA是比蛋白藥大得多的分子——若想表達(dá)一個(gè)分子量為30KD的蛋白，其修飾過(guò)的完整的mRNA分子接近600KD。如何把這么大的分子遞送到細(xì)胞里是第一個(gè)要解決的問(wèn)題。
其次，未加修飾的mRNA會(huì)被人體免疫系統(tǒng)所排斥，還沒(méi)有翻譯成蛋白之前就已被破壞掉。如何保護(hù)mRNA分子是第二個(gè)需要解決的問(wèn)題。
通過(guò)修飾逃過(guò)免疫系統(tǒng)的mRNA進(jìn)入細(xì)胞后，又要和天然的mRNA分子一樣與核糖體結(jié)合，翻譯出蛋白。如何能設(shè)計(jì)出不引起免疫應(yīng)答、又有正常功能的mRNA分子是第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題。
此外，mRNA的測(cè)序、提純、分析、二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)量、檢驗(yàn)也有很多技術(shù)難關(guān)需要攻克。Moderna經(jīng)過(guò)幾年的攻關(guān)，已成為這一平臺(tái)技術(shù)的權(quán)威，并在多個(gè)項(xiàng)目上獲得良好的臨床數(shù)據(jù)，展示了mRNA藥的廣闊應(yīng)用前景。
2020年1月31日，另一家mRNA公司CureVac宣布，他們和CEPI擴(kuò)展了已有的合作協(xié)議，也將啟動(dòng)新冠病毒mRNA疫苗項(xiàng)目。CEPI將增加對(duì)CureVac的資助來(lái)支持這一項(xiàng)目。
mRNA疫苗技術(shù)非常適用于對(duì)新冠病毒感染的預(yù)防。當(dāng)然，nCoV的mRNA疫苗的開(kāi)發(fā)需要時(shí)間，不會(huì)一蹴而就。關(guān)于這點(diǎn)，文末將有簡(jiǎn)短討論。
診斷：CRISPR分子診斷技術(shù)
隨著Cas12、Cas13和Cas14等新的CRISPR系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)，張鋒團(tuán)隊(duì)和Jennifer Doudna團(tuán)隊(duì)在最近幾年創(chuàng)建了CRISPR分子診斷技術(shù)，用來(lái)檢測(cè)RNA或DNA目標(biāo)分子。張鋒博士創(chuàng)立了Sherlock Biosciences公司，Doudna博士創(chuàng)立了Mammoth Biosciences公司，兩個(gè)公司都專(zhuān)注于開(kāi)發(fā)以CRISPR為基礎(chǔ)的IVD技術(shù)。具體過(guò)程請(qǐng)?jiān)斠?jiàn)《連環(huán)畫(huà) | CRISPR分子診斷技術(shù)》。
CRISPR分子診斷技術(shù)建立在Cas12、Cas13和Cas14的特性基礎(chǔ)上。以Cas13a為例，Cas13a-crRNA的靶分子是入侵病原的單鏈RNA。Cas13a-crRNA一旦找到并結(jié)合匹配的RNA后，會(huì)進(jìn)入激活狀態(tài)，除了剪切靶RNA外，還大開(kāi)殺戒，碰到任何單鏈RNA都可非特異性地將其剪切、降解。利用這一特性，Cas13a可以被用來(lái)構(gòu)建高特異性、高靈敏度的RNA檢測(cè)方法。若想檢測(cè)出某一特定序列的RNA分子，先將與其互補(bǔ)的crRNA和Cas13a蛋白組裝，再加上一些報(bào)告RNA分子。常用的一種報(bào)告RNA是一段寡核苷酸：一端附有一個(gè)熒光素（F），另一端有一個(gè)暗淬滅劑（Q）。由于Q的猝滅作用，一個(gè)完整的報(bào)告RNA分子不會(huì)發(fā)出熒光。當(dāng)Cas13a-crRNA抓到特定的靶RNA（activating target RNA）時(shí)，Cas13a的非特異性RNA水解酶的活性會(huì)被激活，剪切報(bào)告RNA，其熒光素?cái)[脫了Q的淬滅，釋放出熒光。這樣，通過(guò)熒光信號(hào)就可以檢驗(yàn)出靶RNA的存在。
經(jīng)過(guò)張鋒團(tuán)隊(duì)和Doudna團(tuán)隊(duì)的不斷改進(jìn)，CRISPR分子診斷技術(shù)同其它分子診斷技術(shù)相比有幾大優(yōu)勢(shì)：
1） 高特異性：可達(dá)到單堿基分辨度。
2） 高靈敏度：能夠檢測(cè)到渺摩爾濃度的靶分子。也就是說(shuō)，即使一微升溶液里只有一個(gè)靶DNA或RNA分子都可以被檢驗(yàn)出來(lái)。
3） 由于DNA常溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RPA）的引入和金標(biāo)格式的開(kāi)發(fā)，CRISPR分子診斷技術(shù)可以做到真正的“儀器自由”，不需要PCR儀，不需要熒光檢測(cè)裝置。診斷使用和驗(yàn)孕棒一樣簡(jiǎn)單、方便。
4） 診斷時(shí)間短：從患者樣品處理到讀取結(jié)果在一個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。
5） 開(kāi)發(fā)周期短：2017年9月，中科院遺傳所的許執(zhí)恒團(tuán)隊(duì)和軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的秦成峰團(tuán)隊(duì)在Science上報(bào)導(dǎo)，塞卡病毒的prM蛋白的一個(gè)突變 (S139N) 增加了其傳染性，并引起更嚴(yán)重的小頭癥和更高的死亡率。張鋒實(shí)驗(yàn)室與哈佛的Pardis Sabeti實(shí)驗(yàn)室合作，在該論文發(fā)表后一周內(nèi)，就已經(jīng)設(shè)計(jì)、開(kāi)發(fā)出幾個(gè)能區(qū)分出S139N病毒突變的SHERLOCK分析方法，包括熒光或顯色格式。
我們可以預(yù)測(cè)，如果開(kāi)發(fā)出以CRISPR為基礎(chǔ)的nCoV檢測(cè)方法，新冠病毒的診斷瓶頸會(huì)得到很大改善。Endpoints News于2020年1月30日?qǐng)?bào)道，Mammoth Biosciences正在開(kāi)發(fā)新冠病毒感染的即時(shí)檢測(cè)方法（POCT）。
治療：中和抗體和超級(jí)抗體
因?yàn)槲覀兠總€(gè)人的抗體基因都不同，針對(duì)同一抗原，每個(gè)人都可能會(huì)產(chǎn)生與眾不同的抗體。另外，由于單細(xì)胞分析技術(shù)和新一代DNA測(cè)序技術(shù)（NGS）的發(fā)展，許多制藥公司現(xiàn)在已經(jīng)能夠從病毒感染痊愈者體內(nèi)找到中和抗體（可抑制病毒感染、裂解細(xì)胞的的抗體）。如果幸運(yùn)的話，我們還可以從這些中和抗體中找到超級(jí)抗體或bnAb：超級(jí)抗體不但能中和感染的病毒，還具有廣度，能抵擋同一屬的其它種病毒。這些中和抗體和超級(jí)抗體可以被開(kāi)發(fā)成蛋白藥，用來(lái)治愈病毒感染患者。具體信息請(qǐng)?jiān)斠?jiàn)《連環(huán)畫(huà) | 超級(jí)抗體》。
單克隆抗體已被證明是一種有效的治療病毒感染方法。2019年8月，由美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院（NIH）、世界衛(wèi)生組織（WHO）及其他政府、公益組織在剛果開(kāi)展的臨床試驗(yàn)初步數(shù)據(jù)顯示，在4個(gè)實(shí)驗(yàn)藥物中，REGN-EB3（在人源小鼠中找到的3個(gè)中和抗體）和mAb114（從1995年埃博拉幸存者體內(nèi)找到的中和抗體）對(duì)埃博拉病毒疾?。‥VD）的療效明顯優(yōu)于ZMapp和Remdesivir，死亡率分別降至29%和34%。患者如果早期使用（癥狀出現(xiàn)4天之內(nèi)）REGN-EB3和mAb114進(jìn)行治療，死亡率會(huì)更低，僅有6%和11%。Remdesivir（瑞德西韋）這幾天成為焦點(diǎn)之一。它是由Gilead開(kāi)發(fā)的小分子藥，將在中國(guó)進(jìn)行針對(duì)新冠病毒感染的三期臨床試驗(yàn)。瑞德西韋對(duì)EVD有一定療效，但效果不如其它單抗藥。
我們可以借鑒EVD超級(jí)抗體MBP134的開(kāi)發(fā)過(guò)程來(lái)研制新冠病毒的抗體藥。從痊愈者的血液中通過(guò)單B細(xì)胞克隆技術(shù)分揀出表達(dá)不同抗體的B細(xì)胞，再篩選出能結(jié)合nCoV表面的S蛋白的抗體，然后從中找到中和抗體。大部分的早期實(shí)驗(yàn)不需要真正的nCoV，只需要重組S蛋白和組裝病毒（表面表達(dá)S蛋白的安全病毒）。只有后期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和猴子實(shí)驗(yàn)因?yàn)橐玫秸嬲牟《荆菚r(shí)P4等級(jí)實(shí)驗(yàn)室才成為必需條件。
一般來(lái)說(shuō)，找到中和抗體并不難，耗時(shí)的往往是篩選超級(jí)抗體、抗體優(yōu)化等步驟。如果時(shí)間緊迫，我們可以直接把中和抗體開(kāi)發(fā)成抗體藥。更理想的療法是由靶向S蛋白不同表位的幾種中和抗體組成的雞尾酒療法。
和其它藥物療法相比，源于志愿者的中和抗體的最大優(yōu)勢(shì)是安全性。由于它完全復(fù)制痊愈患者體內(nèi)的抗體，中和抗體的毒性小，免疫原性弱，成藥性強(qiáng)。中和抗體的另一優(yōu)勢(shì)是其開(kāi)發(fā)周期短——避免了分子設(shè)計(jì)、免疫動(dòng)物或構(gòu)建大規(guī)?？贵w庫(kù)等步驟，有望在幾個(gè)月內(nèi)找到一些中和抗體，作為候選藥物來(lái)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。
1月29日，藥明生物宣布，他們通過(guò)國(guó)際合作，已在開(kāi)發(fā)新冠病毒的中和抗體上取得了一些進(jìn)展，并有望在4-5個(gè)月內(nèi)完成全部開(kāi)發(fā)工作。這是一個(gè)令人歡欣鼓舞的好消息。我們將繼續(xù)關(guān)注。
討論
由于藥物開(kāi)發(fā)的固有周期，很多人質(zhì)疑現(xiàn)在開(kāi)發(fā)新的疫苗或藥物是否為時(shí)已晚。等抗病毒藥走完臨床前實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)，新冠病毒瘟疫很可能已經(jīng)消失。以下是我的幾點(diǎn)看法：
1） 沒(méi)有人能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)疫情的發(fā)展。由于其傳染性強(qiáng)、死亡率低，一種可能出現(xiàn)的情況是新冠病毒肺炎轉(zhuǎn)變成人群慢性感染，成為另一種流感，每年爆發(fā)一次。我們必須做好一切準(zhǔn)備，開(kāi)發(fā)一切可以開(kāi)發(fā)的武器，以防萬(wàn)一。
2） 即使疫情很快的得到改善，我們現(xiàn)在的開(kāi)發(fā)工作對(duì)以后防治類(lèi)似的感染病也會(huì)有幫助。如果Gilead沒(méi)有針對(duì)埃博拉開(kāi)發(fā)瑞德西韋，我們現(xiàn)在對(duì)新冠病毒就少了一個(gè)候選藥物。從這一點(diǎn)上來(lái)說(shuō)，超級(jí)抗體的開(kāi)發(fā)尤為重要。MBP134對(duì)氨基酸序列保守度只有55%的幾種埃博拉病毒屬的病毒成員都有療效。下一次冠狀病毒感染爆發(fā)時(shí)，我們現(xiàn)在開(kāi)發(fā)的超級(jí)抗體藥或許就能派上用場(chǎng)。
3） 很多實(shí)驗(yàn)藥物或疫苗在臨床試驗(yàn)階段就已經(jīng)發(fā)揮了抑制疫情的作用。默沙東的V920疫苗雖然在2019年12月才被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，之前它在剛果已被廣泛使用（compassionate use）來(lái)預(yù)防埃博拉——截至2019年9月已有將近20萬(wàn)人接種該疫苗。又比如，雖然到現(xiàn)在還沒(méi)有被批準(zhǔn)，ZMapp作為實(shí)驗(yàn)藥物在緩解2014-2016西非埃博拉疫情上起了很大作用。
4） 生物制藥公司開(kāi)發(fā)新發(fā)傳染病的疫苗或新藥多半不會(huì)獲得投資回報(bào)。這就需要政府和公益組織給與一定的支持。CEPI出資給Moderna和CureVac用來(lái)開(kāi)發(fā)新冠病毒mRNA疫苗，就是一個(gè)很好的典范。
我們可以不讓歷史重演。醫(yī)藥人有責(zé)任把創(chuàng)新技術(shù)轉(zhuǎn)化成抵抗瘟疫的武器。無(wú)論是個(gè)人，還是商業(yè)、政府或公益組織，在任何情況下，我們都應(yīng)該hope for the best, prepare for the worst。讓我們并肩戰(zhàn)斗，共渡難關(guān)。
參考資料：
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