摘 要：角蛋白作為家禽加工和農(nóng)業(yè)廢棄物的主要成分，因其結(jié)構(gòu)中富含能抵抗普通蛋白酶和化學(xué)催化劑降解的穩(wěn)定交聯(lián)二硫鍵而難以被利用，因此每年都在環(huán)境中大量積累，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。微生物角蛋白酶可將角蛋白廢棄物轉(zhuǎn)化為可再次利用的產(chǎn)物，帶來(lái)了經(jīng)濟(jì)的可行性及環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展。本文主要綜述了角蛋白酶的生物化學(xué)特性、角蛋白酶的基本結(jié)構(gòu)及其表達(dá)特性，總結(jié)了其應(yīng)用價(jià)值及角蛋白降解機(jī)制，最后展望了微生物角蛋白酶的進(jìn)一步研究方向。

角蛋白主要存在于哺乳動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物和鳥類的表皮中，其是形成蹄、指甲、角、喙、羽毛、爪、毛發(fā)和人類皮膚外層的主要結(jié)構(gòu)，包含較多的二硫鍵、氫鍵和疏水作用力，具有化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不溶于水及難降解的特點(diǎn)。數(shù)百萬(wàn)噸的羽毛由于自然堆積時(shí)降解緩慢，附著的糞便、血液等含氮磷物質(zhì)也易成為其他致病菌的營(yíng)養(yǎng)源，處理不當(dāng)將造成環(huán)境污染，這些“難降解”的角蛋白處置和管理方式是家禽養(yǎng)殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)等行業(yè)面臨的主要問(wèn)題之一。但從另一方面來(lái)說(shuō)羽毛等角蛋白廢棄物中含有豐富的蛋白質(zhì)，其中粗蛋白含量在80%以上，角蛋白還含有大量動(dòng)植物生長(zhǎng)必需的氨基酸，如胱氨酸、賴氨酸、脯氨酸等，含量可達(dá)氨基酸總量的70%。目前工業(yè)上常用填埋法、物理法和化學(xué)法處理廢棄羽毛，但具有環(huán)境污染嚴(yán)重、必需氨基酸破壞、耗能高等缺點(diǎn)。此外，由于人類皮膚病原真菌很多是嗜角蛋白真菌，如毛癬菌屬(Trichophyton)、小孢子菌屬(Microsporum)及表皮癬菌屬(Epidermophyton)等，隨意丟棄羽毛會(huì)使環(huán)境中富集這類病原真菌，極大地增加人類疾病的發(fā)生概率。因此，迫切需要一種新型環(huán)保的生物催化劑來(lái)降解角蛋白。鑒于這一事實(shí)，微生物角蛋白酶作為一種有效的生物降解法引起了人們的關(guān)注，因其低成本、易獲得和無(wú)污染的特性已被應(yīng)用于皮革、紡織、制藥等工業(yè)領(lǐng)域。角蛋白酶的微生物來(lái)源廣泛、性質(zhì)各異，因此，選擇合適微生物來(lái)源的角蛋白酶用于工業(yè)生產(chǎn)意義重大。

產(chǎn)角蛋白酶的微生物分布于不同生境中，尤其在羽毛傾倒場(chǎng)、家禽廢物、屠宰場(chǎng)廢物等生境中較為豐富。目前已報(bào)道的產(chǎn)角蛋白酶的微生物主要是細(xì)菌和真菌，如蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)、地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)等，它們產(chǎn)生的熱穩(wěn)定角蛋白酶具有活性較高、分解羽毛效果好的特點(diǎn)；已報(bào)道的產(chǎn)角蛋白酶放線菌主要是鏈霉菌屬(Streptomyces)菌株 ， 如白色鏈霉菌(Str. albus)、弗氏鏈霉菌(Str. fradiae)、革蘭氏鏈霉菌(Str. graminofaciens)、熱硝化鏈霉菌(Str.thermonitrificans) 和 古 巴 爾 古 鏈 霉 菌 (Str.gulbarguensis)等，它們能利用不同的角蛋白底物產(chǎn)生角蛋白酶。最早發(fā)現(xiàn)的角蛋白酶來(lái)源于真菌——馬爪甲團(tuán)囊菌(Onygena equina)，隨后越來(lái)越多能產(chǎn)生角蛋白酶的真菌被報(bào)道，如小孢子菌屬(Microsporum)、金孢霉屬(Chrysosporium)、地絲霉屬(Geomyces)、毛癬菌屬(Trichophyton)、枝頂孢屬(Acremonium)、擬青霉屬(Paecilomyces)和側(cè)齒霉屬(Engyodontium)等。某些真菌角蛋白酶能破壞動(dòng)物及人體皮膚外層角蛋白，從而引起頭癬、體癬和腳癬等皮膚類疾病；此外，由于真菌產(chǎn)生的角蛋白酶生物化學(xué)性質(zhì)多樣，已備受關(guān)注?；诖耍疚闹饕C述了不同微生物角蛋白酶的生化特性、分子生物學(xué)特性，并對(duì)微生物角蛋白酶的應(yīng)用進(jìn)行了介紹，以期為角蛋白酶的相關(guān)研究提供參考。

1 角蛋白酶的生物化學(xué)特性

1.1 一般特性

角蛋白酶的特性因微生物的來(lái)源而異。多數(shù)微生物角蛋白酶是中性或堿性蛋白酶，pH在7.5?9.0之間，一些角蛋白酶在極端堿性或微酸性條件下也具有最佳活性。少數(shù)角蛋白酶在很寬的 pH 范圍內(nèi)也能保持活性穩(wěn)定。如擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)strain TOA-1，所產(chǎn)角蛋白酶能在30°C、pH1.5?12.0范圍內(nèi)保持酶活性24 h。

角蛋白酶的作用溫度與來(lái)源微生物的生存環(huán)境有關(guān)，多數(shù)微生物來(lái)源的角蛋白酶最適溫度在40?70 °C 之間。一株嗜熱厭氧菌閃爍桿菌屬(Fervidobacterium sp.)角蛋白酶最適溫度是80°C，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophila)DHHJ的角蛋白酶在40°C活性最大；在一些特殊條件下，來(lái)源于海島閃爍桿菌(F. islandicum)AW-1角蛋白酶的最佳活性為100°C。角蛋白酶的分子量范圍是18?240kD，但大多數(shù)角蛋白酶的分子量小于50kD。多數(shù)角蛋白酶是單體酶，也存在多聚角蛋白酶，有些角蛋白酶的分子量高達(dá)440kD，詳見(jiàn)表1。

表1  幾種微生物角蛋白酶的生物化學(xué)性質(zhì)

1.2 底物特異性

底物特異性是定義“角蛋白酶”的主要標(biāo)準(zhǔn)之一。角蛋白酶能有效水解酪蛋白、明膠、牛血清白蛋白等可溶性蛋白底物，也能水解羽毛、羊毛、指甲等不溶性蛋白底物。有研究者提出將 K:C(Keratinolytic:Caseinolytic)活性的比率作為參數(shù)來(lái)判斷某種酶作為角蛋白酶的潛力，即在標(biāo)準(zhǔn)條件下，用羽毛角蛋白作為角蛋白分解活性底物，酪蛋白作為酪蛋白分解活性底物 。K:C=0.5 被認(rèn)為是角蛋白酶的理想比率，K:C>0.5 是一種潛在的角蛋白酶，K:C<0.5 是非角蛋白酶。另外，角蛋白酶區(qū)別于其他蛋白酶的一個(gè)顯著特征就是能夠切割疏水性和芳香族氨基酸。角蛋白酶的底物特異性可通過(guò)胰島素氧化 B 鏈水解得到證實(shí)(圖 1)。胰島素 B 鏈由大量疏水氨基酸殘基組成，還含有幾個(gè)帶電荷的側(cè)鏈殘基，半胱氨酸殘基被氧化后能產(chǎn)生 2 個(gè)額外的負(fù)電荷，來(lái)自Thermophilic sp. VC13 的角蛋白酶在氧化半胱氨酸裂解后水解肽鍵；Doratomyces microsporus 角蛋白酶表現(xiàn)出廣泛的特異性，切割位點(diǎn)與蛋白酶 K 的切割位點(diǎn)相似，對(duì)亮氨酸(L)、纈氨酸(V)、酪氨酸(Y)和苯丙氨酸(F)的P1位點(diǎn)上的疏水和芳香氨基酸具有優(yōu)先選擇性。據(jù)報(bào)道，真菌 D. microsporus 角蛋白酶的切割位點(diǎn)最多，有 19 個(gè)。

圖1  胰島素B鏈水解顯示多種角蛋白酶的裂解位點(diǎn)

1.3 抑制劑、金屬離子、有機(jī)溶劑、非離子洗滌劑和還原劑的作用

根據(jù)催化類型，角蛋白酶主要分為絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶。絲氨酸蛋白酶能被苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsulfonyl Fluoride，PMSF)強(qiáng)烈抑制，金屬蛋白酶活性中心含有金屬離子(Ca²⁺、Zn²⁺)，能被乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)和1,10-鄰菲羅啉抑制。Streptomycessp.角蛋白酶被PMSF和EDTA抑制，因此被鑒定為絲氨酸金屬蛋白酶。不同金屬離子對(duì)角蛋白酶活性影響各異。一些金屬離子會(huì)對(duì)角蛋白酶活性起促進(jìn)作用，如Ca²⁺、Mg²⁺能增強(qiáng)角蛋白酶的活性，Fe²⁺及Fe³⁺能提高酶活力，有研究表明Fe²⁺能增加嗜角蛋白金孢霉(C. keratinophilum)角蛋白酶活性。一些過(guò)渡金屬離子及重金屬離子Cu⁺、Hg²⁺、Ag⁺、Pb⁺、Zn²⁺、Ba²⁺、Co⁺可能會(huì)抑制角蛋白酶的活性，這與金屬離子和底物競(jìng)爭(zhēng)酶分子的活性位點(diǎn)有關(guān)。5 mmol/L的K⁺、Ca²⁺、Cu²⁺能提高B. subtilisY3-4角蛋白酶的活性，其中，Cu²⁺提高了其25%的酶活力，而5 mmol/L的Zn²⁺、Ba²⁺、Co⁺、Ni²⁺、Mn²⁺明顯降低了該菌株角蛋白酶活性，Co⁺、Ni²⁺抑制了其 40%左右的酶活，而同樣濃度的Sr²⁺、Li⁺、Na⁺、Mg²⁺則沒(méi)有顯著性影響。非離子洗滌劑和溶劑對(duì)角蛋白酶活性具有抑制、激發(fā)或穩(wěn)定的作用。角蛋白酶通常在有機(jī)溶劑、SDS、DMSO、Triton X-100 中是穩(wěn)定存在的。

對(duì)于嗜麥芽窄食單胞菌(Ste. maltophilia)菌株BBE11-1分泌的 3 種角蛋白酶中的K1、K2來(lái)說(shuō)，非離子去垢劑Triton X-100和吐溫-20促進(jìn)角蛋白酶活性，而離子型去垢劑SDS顯著抑制其活性。據(jù)報(bào)道，還原劑如二硫蘇糖醇(Dithiothreitol，DTT)、β-巰基乙醇(β-Mercaptoethanol，β-ME)、還原型谷胱甘肽、半胱氨酸和亞硫酸鈉能增強(qiáng)角蛋白酶的活性，表明這些酶能夠被硫醇激活，對(duì)于B.licheniformis MUK3所分泌的角蛋白酶，還原劑DTT和β-ME使角蛋白酶活性增加49%?73%。事實(shí)上，還原劑通過(guò)破壞二硫鍵來(lái)促進(jìn)角蛋白酶的水解，體外純化的角蛋白酶只有通過(guò)加入還原劑才能發(fā)揮降解作用。

2 角蛋白酶的分子生物學(xué)特性

2.1 角蛋白酶結(jié)構(gòu)特性

對(duì)角蛋白酶核苷酸序列的研究，有助于解釋其結(jié)構(gòu)-功能的關(guān)系。多數(shù)微生物角蛋白酶與枯草桿菌蛋白酶有很高的序列同源性。目前，已有部分菌株的角蛋白酶基因成功克隆并測(cè)序，如地衣芽孢桿菌 PWD-1、鏈霉菌 SCUT-3、發(fā)癬菌KERB等，其中，以地衣芽孢桿菌角蛋白酶研究最為深入。除了少數(shù)角蛋白酶基因序列，多數(shù)角蛋白酶氮端區(qū)域(AQTVPY)高度保守。地衣芽孢桿菌PWD-1角蛋白酶的氮端序列與Subtilisin Carlsberg相同(表2)，他們同屬于絲氨酸蛋白酶家族，其編碼的基因kerA與Subtilisin Carlsberg相似性達(dá) 99%，與SubtilisinE、Subtilisin BPN相似性為65%，與Fervidolysin相似性為30%。盡管F. pennavorans產(chǎn)生的嗜熱角蛋白酶N端氨基酸序列與枯草桿菌蛋白酶不同，但其活性位點(diǎn)區(qū)域與枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶類似。真菌角蛋白酶 N 端氨基酸序列的比較表明它們與枯草桿菌蛋白酶的關(guān)系比放線菌角蛋白酶的關(guān)系更密切。來(lái)自鏈霉菌的角蛋白酶更接近灰色鏈霉菌(Str. griseus)蛋白酶B，后者是鏈霉素蛋白酶的主要成分。來(lái)自銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)的角蛋白酶N端氨基酸序列顯示出與其他微生物角蛋白酶的相似性較小。

Wu等報(bào)道了臺(tái)灣亞棲熱菌 (Meiothermustaiwanensis)WR-220角蛋白酶MtaKer 1.50 ? 晶體結(jié)構(gòu)，其由信號(hào)肽、N端前肽和成熟蛋白酶3部分組成，該酶是由Asp39、His72 和 Ser224殘基組成的高度保守的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)，并且在成熟的rMtaKer 結(jié)構(gòu)中還發(fā)現(xiàn)了 2 個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)及 2 個(gè)二硫鍵，其中，鈣離子對(duì)蛋白質(zhì)正確折疊和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起著重要作用，二硫鍵可以增強(qiáng)該蛋白的熱穩(wěn)定性，由 Ser130-Leu131-Gly132組成的 S1 結(jié)合口袋是角蛋白酶與底物的結(jié)合位點(diǎn)。Kim等分析了F.pennivorans 1.7 ? 角蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)，其由 1 個(gè)催化結(jié)構(gòu)域、1個(gè)前肽結(jié)構(gòu)域和2個(gè)β-三明治結(jié)構(gòu)域組成；其催化結(jié)構(gòu)域與枯草芽孢桿菌蛋白酶類似，其中，催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)的鈣結(jié)合位點(diǎn)與 Subtilisin E 完全一致，高分子量的角蛋白酶可能由多結(jié)構(gòu)域或寡聚蛋白酶組成，這種多結(jié)構(gòu)域 Fervidolysin 晶體結(jié)構(gòu)為深入了解酶原激活和非催化結(jié)構(gòu)域作用提供了依據(jù)。

表 2 角蛋白酶及枯草桿菌蛋白酶 N 端氨基酸序列的比較

2.2 角蛋白酶氨基酸序列分子進(jìn)化樹

使用MEGA 6.0軟件中鄰接(Neighbor-Joining，NJ)法構(gòu)建部分角蛋白酶的系統(tǒng)發(fā)育樹。其中15個(gè)角蛋白酶的氨基酸序列從NCBI下載，發(fā)癬菌KERB氨基酸序列從文獻(xiàn)獲得，他們均有角蛋白酶活性。從圖2可以看出這些角蛋白酶分為2個(gè)簇，第一個(gè)簇屬于S8蛋白酶家族，其中，Actinomadura keratinilytica和Str. albidoflavus來(lái)源的角蛋白酶獨(dú)立于其他分支，第二個(gè)簇中P. aeruginosa  KS-1 KP1屬于M28蛋白酶家族，P. aeruginosa KS-1 KP2屬于M4蛋白酶家族，雖然他們都來(lái)源于P. aeruginosa KS-1菌株，但親緣關(guān)系十分疏遠(yuǎn)。P.aeruginosa角蛋白酶獨(dú)立于其他角蛋白酶，從而擴(kuò)大了角蛋白酶的范圍。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，S8蛋白酶家族成員通過(guò)催化三聯(lián)體機(jī)制工作，Asp、His和Ser的催化三聯(lián)體及含氧陰離子空穴Asn(N)周圍的區(qū)域在角蛋白酶中都是高度保守的。可對(duì)這些保守區(qū)域設(shè)計(jì)通用引物來(lái)克隆新的角蛋白酶。

圖2  部分角蛋白酶氨基酸序列分子系統(tǒng)樹

注：分支上的數(shù)據(jù)表示 Bootstrap 檢驗(yàn)的支持百分率，自展支持值(Bootstrap)≥50%的顯示在各個(gè)進(jìn)化分支節(jié)點(diǎn)上；括號(hào)內(nèi)的GenBank 登錄號(hào)。

2.3 角蛋白酶的異源表達(dá)

隨著越來(lái)越多的角蛋白酶基因被鑒定出來(lái)，角蛋白酶在工程表達(dá)系統(tǒng)中的異源表達(dá)引起了人們的極大關(guān)注。大腸桿菌由于生長(zhǎng)迅速、易于操作、遺傳背景簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是最常用的表達(dá)宿主，來(lái)源于Ste. maltophilia BBE11-1的2個(gè)角蛋白酶基因kerSMD和kerSMF在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)，P.aeruginosa KS-1的角蛋白酶基因kerP在HB101 中成功表達(dá)。但大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)仍存在一些問(wèn)題，如形成無(wú)活性的包涵體和分泌效率低，角蛋白酶在宿主細(xì)胞中的大量累積會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性和不正確的蛋白質(zhì)折疊，最終導(dǎo)致細(xì)胞溶解和目標(biāo)蛋白前體失活。芽孢桿菌因具有外源蛋白易分泌到胞外、易分離純化、無(wú)致病性等優(yōu)勢(shì)而被廣泛研究。B.licheniformis PWD-1角蛋白酶基因kerA首次在枯草芽孢桿菌DB104中表達(dá)，Radha等在巨大芽孢桿菌MS941和巨大芽孢桿菌ATCC14945中實(shí)現(xiàn)了B.licheniformis MKU3角蛋白酶基因的穩(wěn)定表達(dá)。但是多余的內(nèi)源蛋白酶及質(zhì)粒的不穩(wěn)定性是芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)面臨的主要問(wèn)題。畢赤酵母因具有完善的分泌表達(dá)體系，能將外源蛋白完全分泌至胞外，并且具有外源蛋白翻譯后修飾功能，更適用于真核生物角蛋白酶基因的表達(dá)。來(lái)自 Aspergillus fumigatus 和 P.aeruginosa的角蛋白酶基因在畢赤酵母SMD1165和畢赤酵母SMD1168H中成功表達(dá)。但畢赤酵母系統(tǒng)中的表達(dá)水平強(qiáng)烈依賴于密碼子使用偏好性，Hu等實(shí)現(xiàn)了B.licheniformis S90的角蛋白酶在畢赤酵母中的表達(dá)，并且與在大腸桿菌系統(tǒng)中的表達(dá)相比，通過(guò)密碼子優(yōu)化策略提高了12倍的角蛋白酶產(chǎn)量。人們也在嘗試將新型宿主用于角蛋白酶的表達(dá)，昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(Baculovirus Expression Vector System，BEVS)具有高水平的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)、對(duì)外源基因翻譯后修飾充分、生物安全性好的優(yōu)勢(shì)，已被廣泛用于醫(yī)學(xué)研究、藥物研發(fā)、疫苗生產(chǎn)等眾多領(lǐng)域。Huang等首次使用昆蟲細(xì)胞 Spodoptera frugiperda (sf9)成功表達(dá)了來(lái)自B. licheniformis PWD-1的角蛋白酶基因，酶活635 U/mg，這為人們選擇表達(dá)宿主提供了新思路。

3 角蛋白酶的應(yīng)用

微生物角蛋白酶是用于角蛋白降解的特異酶，已在動(dòng)物飼料、生物肥料、洗滌工業(yè)、皮革和紡織工業(yè)等方面得到應(yīng)用 ，在其他生物技術(shù)領(lǐng)域如制藥和生物醫(yī)學(xué)等方面也具有重要應(yīng)用潛力。

3.1 飼料及肥料中的應(yīng)用

角蛋白水解產(chǎn)物富含改善動(dòng)物飼料的必需氨基酸，當(dāng)角蛋白酶與動(dòng)物飼料一起添加時(shí)，能有效改善動(dòng)物對(duì)飼料的吸收利用，加速動(dòng)物生長(zhǎng)，提高消化率。據(jù)報(bào)道，在含有羽毛粉的動(dòng)物飼料中添加玫瑰考克氏菌(Kocuria rosea)，能有效提高組氨酸、蛋氨酸和賴氨酸的含量。角蛋白酶還能夠分解朊病毒蛋白(Prion Protein，Prp Sc)，使肉制品安全地供動(dòng)物食用，Versazyme和CibenzaDP100TM是從地衣芽孢桿菌 PWD-1中獲得的2種商業(yè)角蛋白酶，在肉雞飼料中添加 Versazyme能夠促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)及消化。金黃桿菌屬(Chryseobacterium spp.)菌株水解羽毛產(chǎn)物已經(jīng)用于提高香蕉植物的含氮量，并能促進(jìn)其他植物根和芽的生長(zhǎng)。

3.2 沼氣生產(chǎn)

將角蛋白廢棄物經(jīng)微生物處理可轉(zhuǎn)化為可再生能源沼氣，用于改善衛(wèi)生條件、保護(hù)生態(tài)環(huán)境、解決能源短缺等問(wèn)題。有研究表明可通過(guò)兩步法來(lái)產(chǎn)生沼氣：第一步：由角蛋白酶產(chǎn)生菌水解角蛋白底物；第二步：由熱球菌進(jìn)一步將水解產(chǎn)物降解為小分子，如氫氣；此外，通過(guò)補(bǔ)充角蛋白水解產(chǎn)物，進(jìn)一步產(chǎn)生甲烷氣體。有研究表明用B.megaterium 作為角蛋白酶產(chǎn)生菌處理雞毛，能夠產(chǎn)生甲烷氣體，將羽毛水解物與稀釋的豬糞在厭氧條件下消化，比單獨(dú)用豬糞發(fā)酵能產(chǎn)生更多的甲烷。

3.3 洗滌劑中的應(yīng)用

角蛋白酶的生物化學(xué)性質(zhì)決定了其能夠耐受各種表面活性劑、洗滌劑及各種有機(jī)化學(xué)試劑。有研究表明B.subtilis產(chǎn)生的角蛋白酶能清除棉布衣服上的血液污漬，將角蛋白酶加入商業(yè)洗滌劑中，有強(qiáng)化去除污漬的效果，將B.pumilusGRK產(chǎn)生的角蛋白酶加入洗滌劑，在不損壞紡織品前提下，成功地去除了衣服上的血漬。

3.4 皮革和紡織工業(yè)中的應(yīng)用

在皮革工業(yè)中，去除動(dòng)物身上的毛發(fā)而不損壞皮膚是脫毛過(guò)程遇到的巨大挑戰(zhàn)之一，角蛋白酶由于其底物特異性，可被用于皮革工業(yè)的脫毛過(guò)程，具有綠色、無(wú)二次污染、經(jīng)濟(jì)等顯著優(yōu)點(diǎn)。來(lái)自B.paralicheniformis MKU3的角蛋白酶能有效對(duì)羊皮進(jìn)行100%的脫毛而不損壞皮革表層，這個(gè)過(guò)程因?yàn)闆](méi)有用硫化物等進(jìn)行預(yù)處理，因此被稱為無(wú)化學(xué)物質(zhì)脫毛過(guò)程。

3.5 醫(yī)藥方面的應(yīng)用

角化過(guò)度通常發(fā)生在手指背面的外層皮膚，其主要成分是角蛋白，基于角蛋白酶的藥物Keratoclean? Hydra PB及Pure100可用于治療皮層角化過(guò)度癥狀。痤瘡是由于過(guò)多的角蛋白阻塞了皮脂腺而形成。Keratoclean Sensitive PB和KeratopeelPB已用于痤瘡治療。朊病毒是導(dǎo)致傳染性和致命性腦部疾病的關(guān)鍵傳染性蛋白質(zhì)之一。羽毛分解產(chǎn)生的角蛋白酶具有切割 β-角蛋白結(jié)構(gòu)的功能；因此，它們可以降解具有 β 折疊片的朊病毒蛋白(PrP Sc)。地衣芽孢桿菌PWD-1是發(fā)現(xiàn)的首個(gè)能產(chǎn)生降解PrP Sc角蛋白酶的菌株，另外，Pure100

已被用于水解手術(shù)器械中的朊病毒。由于角蛋白酶可以分解指甲等基質(zhì)中的角蛋白，因此可以增強(qiáng)藥物的滲透性，提高疾病的治療效果。綜上，角蛋白酶的應(yīng)用范圍非常廣，除上述領(lǐng)域外，角蛋白酶也可以應(yīng)用到化妝品和護(hù)膚品中更好地幫助營(yíng)養(yǎng)成分的吸收，今后仍需在更多的應(yīng)用領(lǐng)域繼續(xù)探索。

4 展望

4.1 角蛋白降解微生物資源篩選

盡管目前已陸續(xù)報(bào)道了一些角蛋白降解微生物，但不同的微生物對(duì)不同底物的降解效果不同。因此仍有大量資源值得進(jìn)一步篩選并進(jìn)行降解效果評(píng)價(jià)，同時(shí)，不同角蛋白酶在不同環(huán)境條件下的酶活不同，導(dǎo)致降解效果不同；為適應(yīng)不同條件下角蛋白酶對(duì)底物進(jìn)行高效降解，開發(fā)具有廣泛底物特異性和較高催化活性的新型角蛋白酶勢(shì)在必行。因此極端環(huán)境中的角蛋白降解微生物如嗜熱和嗜鹽微生物等，值得廣泛關(guān)注。此外，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，篩選的技術(shù)手段也需要改進(jìn)，利用高通量測(cè)序技術(shù)、基因組數(shù)據(jù)庫(kù)及生物信息學(xué)的方法來(lái)分析和發(fā)現(xiàn)新的角蛋白酶和新的角蛋白降解微生物是一個(gè)有效途徑。

4.2 微生物角蛋白酶的生物降解機(jī)理

迄今角蛋白的生物降解機(jī)制還未探明，但有多種假設(shè)，如酶解理論、硫解理論及物理壓力理論等。但確定的是一個(gè)有效的角蛋白降解過(guò)程必然包括：二硫鍵的還原以及角蛋白多肽鏈的水解。二硫鍵的破壞是角蛋白酶進(jìn)入角蛋白底物的先決條件。酶解理論認(rèn)為，二硫鍵還原酶先對(duì)底物中的二硫鍵進(jìn)行還原，然后，角蛋白酶能順利進(jìn)入角蛋白底物內(nèi)部進(jìn)行水解。盡管羽毛角蛋白很難被蛋白水解酶降解，但角蛋白酶和真菌菌絲體機(jī)械破壞相結(jié)合可以較好地完成這項(xiàng)復(fù)雜工作，真菌菌絲在含有角蛋白底物的培養(yǎng)基中不斷生長(zhǎng)并侵入角蛋白，其肽鍵逐漸暴露于角蛋白酶下，進(jìn)而被降解。雞毛中的 β-角蛋白很難被普通蛋白水解酶水解，研究發(fā)現(xiàn)Microsporum fulvum 菌絲對(duì)角蛋白的物理壓力及其分泌的角蛋白酶對(duì)角蛋白的水解增強(qiáng)了其對(duì)底物的降解能力，最后將含角蛋白的基質(zhì)全部降解。因此，不同微生物產(chǎn)生的角蛋白酶特性不同，再加上角蛋白結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，使角蛋白酶對(duì)底物的降解可能有不同機(jī)制，未來(lái)仍需深入研究。

4.3 角蛋白酶的蛋白質(zhì)工程

在工業(yè)應(yīng)用當(dāng)中，角蛋白酶需要更高效、高產(chǎn)和耐熱的特性。蛋白質(zhì)工程中關(guān)鍵技術(shù)的成熟，為改造蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)使其具有新的特征和更高的產(chǎn)能提供了機(jī)會(huì)。

提高異源宿主中角蛋白酶產(chǎn)量最重要的因素是篩選高分泌效率的信號(hào)肽，信號(hào)肽是指導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到分泌途徑的短肽鏈。Tian等對(duì)B.subtilis SCK6 信號(hào)肽進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)使用SP LipA信號(hào)肽的角蛋白酶的胞外活性比野生型高1.95倍。Fu等構(gòu)建了包含173種不同Sec型信號(hào)肽的文庫(kù)，認(rèn)為幾乎沒(méi)有任何通用的最佳信號(hào)肽適用于所有異源蛋白質(zhì)。因此，系統(tǒng)優(yōu)化最佳信號(hào)肽是促進(jìn)不同異源表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生角蛋白酶的有力策略。

在前肽自主加工過(guò)程中，前肽結(jié)構(gòu)在輔助蛋白質(zhì)成熟和結(jié)構(gòu)重排中起到重要作用，“前肽工程”聚焦于對(duì)角蛋白酶前肽的修飾，以提高酶的產(chǎn)量及催化特性。Sharma等對(duì)角蛋白酶KerP的N末端區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)截短，發(fā)現(xiàn)隨著截短長(zhǎng)度的延長(zhǎng)，酶活性逐漸降低，只有187 bp前序列區(qū)域是角蛋白酶KerP正確折疊并且具有活性所需的最小長(zhǎng)度。因此，前序列的大小直接影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象，從而導(dǎo)致酶動(dòng)力學(xué)的改變。角蛋白酶Sfp2的氮端前序列的定點(diǎn)突變使酶的比活性和蛋白質(zhì)產(chǎn)量提高了9倍。“前肽工程”可利用定點(diǎn)突變、交換、嵌合體和基因重組手段對(duì)蛋白質(zhì)的前肽區(qū)域進(jìn)行修飾，其是提高蛋白酶產(chǎn)量和產(chǎn)生特定突變體很有前途的技術(shù)。

據(jù)報(bào)道，一些不必要的氨基酸或結(jié)構(gòu)域存在于酶的碳末端，影響催化效率和酶的性質(zhì)。部分截短角蛋白酶的C末端序列可以提高其催化效率、嗜熱性、耐鹽性和耐洗滌劑性。因此，碳末端修飾已被探索為一種新的蛋白質(zhì)工程策略。

蛋白酶最重要的區(qū)域是其催化中心以及和底物的結(jié)合區(qū)。對(duì)蛋白酶催化中心的電子分析以及定點(diǎn)突變可以提高酶的催化效率，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬角蛋白酶 KerSMD的3D結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，該酶口袋的入口或底部的4個(gè)殘基可能與底物特異性相關(guān)，通過(guò)突變這些殘基使S1口袋擴(kuò)大，發(fā)現(xiàn)酶的催化效率提高且可水解大分子底物。這些研究為角蛋白酶中催化中心結(jié)合囊、催化能力和底物特異性之間的互作提供了依據(jù)。

多種突變策略的組合可能會(huì)通過(guò)協(xié)同作用對(duì)角蛋白酶產(chǎn)生疊加效應(yīng)。用具有更高催化效率的同源蛋白酶KerSMF的前肽和碳末端結(jié)構(gòu)域取代KerSMD的相關(guān)區(qū)域，發(fā)現(xiàn)角蛋白酶 KerSMD的催化能力和熱穩(wěn)定性都有提高。此外，同時(shí)進(jìn)行多位點(diǎn)突變可以作為一種有效的方法來(lái)改善和定制角蛋白酶。