雌激素、胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ對(duì)體外培養(yǎng)雞胚脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的影響
李新鋒【摘要】： 隨著組織工程學(xué)的不斷發(fā)展,對(duì)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞在體內(nèi)和體外的研究也越來(lái)越深入。國(guó)內(nèi)外大量的研究人員利用定量活體標(biāo)記技術(shù)對(duì)哺乳類(lèi)動(dòng)物(包括人類(lèi))、嚙齒類(lèi)動(dòng)物、禽類(lèi)及野生動(dòng)物如蝙蝠等不同種屬動(dòng)物的生長(zhǎng)板生長(zhǎng)、發(fā)育,病變發(fā)生、損傷修復(fù)機(jī)制和軟骨內(nèi)成骨過(guò)程等領(lǐng)域進(jìn)行了廣泛而深入的研究。鑒于雞胚四肢骨骼是研究骨骼發(fā)育較為理想的模型之一,同時(shí)為了更深入研究生長(zhǎng)板軟骨發(fā)育不良相關(guān)疾病,如肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良(tibial dyschondroplasia, TD),有必要對(duì)肉雞脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。通過(guò)對(duì)獲得的生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)及發(fā)育特征以及對(duì)生長(zhǎng)板軟骨的全身和局部調(diào)節(jié)因子如雌激素和胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ對(duì)其增殖和分化的影響的研究,為肉雞脛骨軟骨生長(zhǎng)板軟骨發(fā)育不良等疾病的深入研究,以及人類(lèi)和其它動(dòng)物的軟骨體外修復(fù),提供借鑒。 試驗(yàn)一、雞胚脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定 目的：建立雞胚脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的高效分離法,并對(duì)其進(jìn)行鑒定。方法：設(shè)計(jì)以1 mg?mL-1的Ⅱ型膠原酶兩步消化法,分離制備脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞,觀察其對(duì)12～20胚齡雞脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的分離效果；采用不同的染色方法,在倒置顯微鏡和光鏡下觀察體外培養(yǎng)條件下軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特性。結(jié)果：(1)Ⅱ型膠原酶兩步消化可使生長(zhǎng)板軟骨基質(zhì)完全解離降解,細(xì)胞均分離,細(xì)胞存活率達(dá)90%以上；(2)前兩代細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)呈圓形或多角形,單個(gè)鋪開(kāi)時(shí)體積較大,生長(zhǎng)匯合時(shí)呈卵圓形,Ⅱ型膠原免疫組化和甲苯胺藍(lán)(TB)異染反應(yīng)均呈陽(yáng)性；第4代以后細(xì)胞逐漸變?yōu)殚L(zhǎng)梭形,Ⅱ型膠原免疫組化染色減弱,TB異染反應(yīng)陰性；(3)前三代軟骨細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)下去,能逐漸匯合,并形成軟骨塊狀組織,堿性磷酸酶染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色強(qiáng)陽(yáng)性,甲苯胺藍(lán)染色異染反應(yīng)較強(qiáng),茜素紅染色能觀察到鈣化結(jié)節(jié)。結(jié)論：采用兩步Ⅱ型膠原酶消化分離雞胚脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞,具有細(xì)胞收獲率、細(xì)胞存活率高、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)；隨著傳代培養(yǎng)次數(shù)的增加,生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞出現(xiàn)去分化,逐漸失去軟骨細(xì)胞的特異性表型；軟骨細(xì)胞若有合適附著基質(zhì),長(zhǎng)期培養(yǎng)下去能保持較強(qiáng)的成骨能力。 試驗(yàn)二、雌激素對(duì)體外培養(yǎng)雞胚脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞增殖分化的影響 目的：在建立雞胚脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上,研究雌激素對(duì)雞胚脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞增殖、分化和代謝功能的影響。方法：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第二代軟骨細(xì)胞接種于96孔板,添加不同濃度的雌激素,分別用MTT法、PNPP法測(cè)定軟骨細(xì)胞增殖率和軟骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)活性,用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的鈣、磷、ALP含量。結(jié)果：(1)36 h,54 h,25～1600 pg?mL-1的雌激素均顯著促進(jìn)了軟骨細(xì)胞的增殖(P0.01)。其中,作用54 h,200,400,800pg?mL-1的雌激素促增殖作用顯著；(2)54 h,400、800 pg?mL-1的雌激素顯著促進(jìn)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞內(nèi)ALP活性(P0.01),1600 pg?mL-1的雌激素則顯著抑制軟骨細(xì)胞內(nèi)ALP活性(P0.01)；(3)細(xì)胞培養(yǎng)液中鈣濃度：在36 h,400、800 pg?mL-1雌激素作用下,明顯降低,18 h,400 pg?mL-1,明顯升高,54 h,隨雌激素的濃度增加而增加；磷濃度：400、800 pg?mL-1雌激素作用下,在各個(gè)時(shí)間段都處于較高的水平；ALP活性：在18 h,對(duì)照組和800 pg?mL-1含量較高,36 h,100、200、800 pg?mL-1明顯降低,54 h,隨濃度的增加,各組ALP呈下降趨勢(shì)。結(jié)論：雌激素能顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖；使軟骨細(xì)胞內(nèi)的ALP顯著增加；但濃度越大,則呈現(xiàn)明顯的抑制作用；細(xì)胞培養(yǎng)液中鈣、磷隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增高,ALP則隨時(shí)間增加而降低。 試驗(yàn)三、胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ對(duì)體外培養(yǎng)雞胚脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞增殖分化的影響 目的：在建立雞胚脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上,研究重組IGF-Ⅰ對(duì)雞胚脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞增殖、分化和代謝功能的影響。方法：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第二代軟骨細(xì)胞于96孔板上進(jìn)行重組IGF-Ⅰ作用下,用MTT法測(cè)定軟骨細(xì)胞增殖率,PNPP法測(cè)定軟骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)活性,并用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中的鈣、磷及ALP含量。結(jié)果：(1)在36 h,10、15、20 ng?mL-1的IGF-Ⅰ使軟骨細(xì)胞增殖受到抑制(P0.01),隨作用時(shí)間的增加各種濃度作用下的軟骨細(xì)胞,均有增殖,但差異不顯著；(2)在36 h,10、20、40 ng?mL-1的IGF-Ⅰ可顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞內(nèi)ALP活性(P0.01)。54 h,20、40 ng?mL-1的IGF-Ⅰ可顯著促進(jìn)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞內(nèi)ALP活性(P0.01)；(3)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中的鈣、磷隨IGF-Ⅰ濃度的增加而減少,隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),其濃度有所增加。在18 h,10 ng?mL-1的IGF-Ⅰ抑制了生長(zhǎng)板軟骨培養(yǎng)液中ALP的活性,20、40 ng?mL-1的IGF-Ⅰ促進(jìn)了軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中ALP的活性。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),ALP活性下降。結(jié)論：IGF-Ⅰ不能顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖；但能顯著增加軟骨細(xì)胞內(nèi)ALP的活性；隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞培養(yǎng)液中的鈣、磷有所增加,而ALP則下降。
【關(guān)鍵詞】：
生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞雌激素胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ鑒定增殖分化 【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：S831
【目錄】： 摘要7-9
ABSTRACT9-13
符號(hào)及縮略語(yǔ)說(shuō)明13-15
上篇 文獻(xiàn)綜述15-37
第一章 軟骨內(nèi)成骨研究進(jìn)展15-21
1 軟骨內(nèi)成骨的過(guò)程15-16
2 生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的分區(qū)及其功能16-20
2.1 靜止細(xì)胞帶(The resting zone)17
2.2 增殖細(xì)胞帶(The proliferating zone)17-18
2.3 軟骨細(xì)胞肥大帶(The hypertrophic zone)18-19
2.4 鈣化帶(The calcified zone)19
2.5 骨化帶(The ossification zone)19-20
3 軟骨細(xì)胞凋亡(The apoptosis of the chondrocyte)20-21
第二章 雌激素和IGF-Ⅰ對(duì)脛骨生長(zhǎng)板軟骨作用的研究進(jìn)展21-30
1 雌激素對(duì)脛骨生長(zhǎng)板軟骨的作用21-23
1.1 體內(nèi)研究21-22
1.2 基因敲除動(dòng)物模型22-23
2 IGF-Ⅰ對(duì)脛骨生長(zhǎng)板軟骨的作用23-26
2.1 GH和IGF-Ⅰ對(duì)骨縱向生長(zhǎng)的假說(shuō)23-24
2.2 全身性和局部IGF-Ⅰ對(duì)骨縱向生長(zhǎng)的作用24
2.3 IGF系統(tǒng)在脛骨生長(zhǎng)板軟骨中的分布24-26
參考文獻(xiàn)26-30
第三章 肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良研究進(jìn)展30-37
1 臨床癥狀30
2 病因30-33
2.1 生長(zhǎng)因子30-31
2.2 維生素D_3及其代謝物31
2.3 遺傳因素31
2.4 營(yíng)養(yǎng)因素31-32
2.5 飼養(yǎng)管理32-33
3 病理發(fā)生33-34
4 防治34
4.1 遺傳選育34
4.2 維生素D_3及其衍生物34
4.3 減緩生長(zhǎng)速度34
5 展望34-35
參考文獻(xiàn)35-37
下篇 試驗(yàn)研究37-79
第四章 雞胚脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定37-59
1 材料與方法37-41
1.1 材料37-38
1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物37-38
1.1.2 主要試驗(yàn)試劑38
1.1.3 主要儀器及設(shè)備38
1.2 方法38-41
1.2.1 雞胚脛骨生長(zhǎng)板石蠟切片染色觀察38-39
1.2.1.1 脛骨組織石蠟切片38
1.2.1.2 H?E染色38-39
1.2.1.3 甲苯胺藍(lán)染色39
1.2.2 雞胚脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)39-40
1.2.3 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察40
1.2.4 體外培養(yǎng)雞胚脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的Ⅱ型膠原免疫組化檢測(cè)40
1.2.5 體外培養(yǎng)雞胚脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的染色觀察40-41
1.2.5.1 Gimsa染色40-41
1.2.5.2 H?E染色41
1.2.5.3 甲苯胺藍(lán)染色41
1.2.5.4 堿性磷酸酶染色41
1.2.5.5 茜素紅染色41
2 結(jié)果41-53
2.1 脛骨組織石蠟切片41-44
2.2 倒置顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞44-47
2.3 Ⅱ型膠原免疫組化染色47-49
2.4 甲苯胺藍(lán)染色49-50
2.5 常規(guī)染色結(jié)果50-53
3 討論53-56
3.1 關(guān)于生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的研究53-54
3.2 生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)54-55
3.3 關(guān)于生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)55-56
3.4 雞胚脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的染色鑒定56
4 小結(jié)56-57
參考文獻(xiàn)57-59
第五章 雌激素對(duì)體外培養(yǎng)雞胚脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞增殖分化的影響59-69
1 材料與方法59-61
1.1 材料59-60
1.2 方法60-61
1.3 數(shù)據(jù)分析61
2 結(jié)果61-65
2.1 雌激素對(duì)體外培養(yǎng)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞作用的OD值61-62
2.2 雌激素對(duì)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞內(nèi)ALP的OD值62-63
2.3 雌激素對(duì)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中鈣、磷、ALP的影響63-65
3 討論65-66
4 小結(jié)66-67
參考文獻(xiàn)67-69
第六章 IGF-Ⅰ對(duì)體外培養(yǎng)雞胚脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞增殖分化的影響69-79
1 材料與方法70-71
1.1 材料70
1.2 方法70-71
2 結(jié)果71-74
2.1 IGF-Ⅰ對(duì)體外培養(yǎng)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞作用的OD值71-72
2.2 IGF-Ⅰ對(duì)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞內(nèi)ALP影響的OD值72-73
2.3 IGF-Ⅰ對(duì)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中鈣、磷、ALP的影響73-74
3 討論74-76
4 小結(jié)76-77
參考文獻(xiàn)77-79
全文總結(jié)79-81
創(chuàng)新之處81-83
致謝83-85
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文85-87
附錄87-88
