個人工作多年以后再回來讀博的，所以實驗技術什么的從頭學起，這其中WB走的彎路最多，現(xiàn)在就和大家聊聊我個人的歷程，并交流一下自己的經(jīng)驗。這個經(jīng)驗是我跑一個11KD分子量分泌性蛋白得出的，肯定不會適用于所有情況，但是論壇里面受困于小分子量蛋白WB的朋友還是很多，所以聊勝于無，在此分享一下。
我搞得蛋白質是一個11KD的分泌性蛋白，并且是我實驗設計中一個重要的指標，最初學習WB技術，受困于二抗不合格一直連內參都做不出來。。。后面改換抗體之后，才相對順利一點，其他指標也相繼出來了。所以抗體真的很重要。
但是在做WB實驗的7、8個月過程中，我的核心的一個蛋白一直處于混沌狀態(tài)，可能跑30次能現(xiàn)身一次，現(xiàn)身之后又沒影好幾個月，就這樣捉摸不定，搞得我很煩，但又無可奈何。詢問了實驗室的同學們，說法各一：1、有人說小分子量蛋白就是難跑，為什么難大家也說不清楚。2、有的說分泌性蛋白本身胞內含量少，不好跑，需要加大上樣量，似乎也是實話。3、還有的說小分子量蛋白容易降解，你的蛋白質降解了吧，我姑且信了。但是95%的時候我跑出的條帶都是大白板，縱然我通過PCR、細胞的免疫熒光都能夠發(fā)現(xiàn)這個蛋白，但是就是WB做不出來，4、也有朋友告訴我說分泌型蛋白你還是做ELISA吧，可是一來這個蛋白的ELISA試劑盒好貴的，二來我就是想做WB。。。。
這一求索就是幾個月的時間。期間一直覺得電泳沒什么技術含量，電轉的過程才是重點，于是糾結于電轉條件；也糾結過電轉液的配置等。就在最近，再次翻閱論壇里面大神的回帖，其中一個大神提到：小分子量蛋白容易在電泳過程中彌散，電泳在壓縮膠里多壓一會，在分離膠里面跑一半就好了。對這個話百思不得其解，于是開始查詢一些實驗技術方面的文獻，其中有幾篇文獻對我很有啟發(fā)，其中有些技術原理方面的內容如下：
在含SDS緩沖液的樣品中，小分子多肽的濃縮是較困難的，因為小分子多肽與SDS形成的復合體具有與SDS本身類似的電荷和大小，所以偏離了相對遷移率和分子質量對數(shù)的相互關系，因此濃縮對于小分子多肽的SDS-PAGE來說就成了一個突出問題。
于是回去翻了翻自己曾經(jīng)偶然跑出來的條帶的模樣，給我的感覺就是壓縮的不好，然后還有彌散的現(xiàn)象（就是那種蛋白暈開的模樣，例如這條帶下面的波浪邊緣，當然也可能是膠不均勻的原因吧，反正我當時就覺得是彌散的現(xiàn)象
然后在論壇里面還看到一個建議就是用0.2%的戊二醛固定轉膜完成后的條帶45分鐘，然后再進行后續(xù)封閉漂洗等步驟，為的就是防止小分子蛋白在后續(xù)操作中洗脫了。于是乎說干就干，開始了我的再次改進的實驗歷程，說來簡單，實際上從25號到1號，一共8天時間，我大概做了12次WB
1、電轉液中一定不要加SDS。對于大分子量蛋白加入SDS是為了增加轉膜效率，道理上是增加了蛋白表面電荷。而對于小分子量蛋白，SDS千萬不能加，否則會封閉小分子蛋白的抗原位點（我忘記從哪里看到的了，文獻不能在這里給出，大家勿吐槽我哈）
2、從最開始糾結于電轉過程，使勁摸索電轉條件，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)電泳過程同樣很重要啊。電轉的時候其實只要預染marker只要轉到膜上了，那么你的相應分子量的目的蛋白也就轉過去了，所以這就是你摸索條件的指示帶。
3、電泳過程中有推薦TRICINE-SDS-PAGE膠來進行電泳，會更有利于小分子量蛋白的分離，研讀了一些文獻，這個效果應該還是很肯定的，但是鄙人沒有做過這種電泳，所以給不了什么經(jīng)驗，我最終還是用普通SDS-PAGE膠做出來的，不過鑒于我的蛋白分子量是11KD，那么假如你是幾KD甚至更小分子量的多肽，那么還是建議你用TRICINE-SDS-PAGE膠來電泳吧。
4、在我用SDS-PAGE膠進行電泳過程中，一直以來都是按照說明書配制壓縮膠和分離膠的，并且在說明書中，以配置2塊膠為例，分離膠說明書中是讓配置10ml，壓縮膠是3ml。我一直以為是對應關系，在這次大悟之后我發(fā)現(xiàn)分離和壓縮完全不是一對一對應關系，人家只是給了你配置這么多體積膠的配方而已，雖然在一個縱列上，但是絕不是對應關系（我確實才覺悟，高手輕鄙視哈）。
5、接上一條經(jīng)驗，所以我在配膠過程中，下層分離膠配制了10ml，但是實際上每塊玻板里面只加了大概3.5ml吧，也就是整個玻板高度的60-70%的樣子。然后壓縮膠配了6ml，玻板填滿插梳子，等凝固。這里我就是想讓我的小分子蛋白盡量在濃縮膠里面多濃縮、壓扁，這樣后續(xù)再分離膠里面，即使彌散一些，也總還有剩下的。
6、電泳開始，在濃縮膠層里面跑的時候，我是60-70V電壓，跑了大概快一個小時，反正就是溴酚藍都集中在上下層膠的那個界面的位置，并且在界面那里好半天都不動了，那么這個過程我理解就是小分子量蛋白雖然表面電荷和膠里面的SDS相當，但是終究還是會沿著電流方向定向移動的，所以就多壓一會吧。然后開始調整電壓為110-120V在分離膠里面跑，我是跑到分離膠一半的位置就停止電泳了，這時候marker已經(jīng)分開一些了。
7、接上一條，marker分開了一些，但是實話說分的并不好，你如果想同時測好幾個蛋白指標是很困難的，不好切膠，也不好敷條帶，所以我的建議，小分子蛋白就單獨出來跑吧。
8、電泳完成后，開始電轉，電轉過程我試過90V恒壓60分鐘，也試過250ma恒流15分鐘，對于我的蛋白都能得到滿意結果。
9、轉膜后條帶是否必須戊二醛固定？經(jīng)過我的嘗試，對于我的11KD蛋白來說固定不固定沒有影響，那么即使固定了，戊二醛也不會影響后續(xù)的抗原抗體反應。所以各位同學們固定不固定隨意吧，假如你的蛋白分子量很小，也許5KD以下？那么固定一下也未嘗不可。
10、抗原抗體反應很靈敏，我的抗體在免疫熒光上面已經(jīng)驗證過的，所以敷抗體的過程沒什么說的。不過抗體稀釋比例的話，我是習慣提高濃度的，說明書1：1000，我就1：500。這個沒有依據(jù)，純癖好，也是師兄們教的。。。
11、顯影這一步我覺得也有可說的。我試過多次，發(fā)現(xiàn)我的這個蛋白第一遍滴加顯影液后條帶不會很清晰，然后你可以把條帶拿出來就放一邊讓它反應一會，然后再放回機器里面，重新滴加顯影液顯影，效果就會好不少。還有顯影時間，結合我的示例，機器給出的自動曝光時間是30幾秒，我就直接加1分鐘改為1分30幾秒，然后就得到了下面的條帶
第一遍顯影條帶，可以看到模糊有東西，但是不清楚，于是我拿出來放一邊反應一下。
反應幾分鐘后，我再把條帶放進機器，時間上直接增加1分鐘，再滴加新的顯影液，是不是好了很多
到這里我就總結完了我的經(jīng)驗和教訓。當然這78個月的摸索，還有很多想說的，但是限于篇幅和敘事能力有限，就大致總結了幾條，有些啰嗦，見諒。希望對還被小分子量蛋白WB折磨的朋友們有幫助。
