吳家睿 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所 研究員
導(dǎo)讀
腫瘤患者廣泛存在著個(gè)體之間的差異以及個(gè)體的腫瘤組織內(nèi)部差異，需要通過生物標(biāo)志物來區(qū)分和確定對藥物具有不同響應(yīng)的個(gè)體。因此，生物標(biāo)志物在抗腫瘤藥物研發(fā)中起著重要的作用。
抗腫瘤藥物研發(fā)是當(dāng)前創(chuàng)新藥物研發(fā)最活躍的領(lǐng)域，也是生物標(biāo)志物最能夠體現(xiàn)'英雄用武'之領(lǐng)域。腫瘤患者不僅廣泛存在著個(gè)體異質(zhì)性（Inter-tumour heterogeneity），而且在每個(gè)個(gè)體的腫瘤組織中也普遍存在內(nèi)部差異（Intra-tumour heterogeneity），因此需要通過生物標(biāo)志物來區(qū)分和確定對藥物具有不同響應(yīng)的個(gè)體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，如果在腫瘤臨床試驗(yàn)中納入正確的生物標(biāo)志物，可將藥物最終獲批的可能性提高10％到25％。
美國食品與藥品管理局（Food and Drug Administration, FDA）在2018年度批準(zhǔn)了多個(gè)基于伴隨診斷的腫瘤分子靶向藥物，例如用于治療攜帶ALK基因重組的非小細(xì)胞肺癌的藥物“Lorlatinib”。隨后FDA進(jìn)一步推出了一個(gè)伴隨診斷分類標(biāo)簽指南草案，主要針對個(gè)體化抗腫瘤藥物伴隨診斷的分類標(biāo)簽，即在特定情況下，如果試驗(yàn)證據(jù)足以證明某一伴隨診斷產(chǎn)品適用于一組或一類治療藥物，則該診斷產(chǎn)品的預(yù)期用途或適應(yīng)證將涵蓋這些藥物，而不限于單個(gè)藥物。這些情況表明，FDA已經(jīng)把生物標(biāo)志物視為抗腫瘤藥物研發(fā)和應(yīng)用的主要基礎(chǔ)。
最主要的腫瘤生物標(biāo)志物：基因變異
腫瘤的形成和發(fā)展源于大量的基因變異，每一種腫瘤往往都具有成百上千的基因變異。因此，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞基因組的DNA序列變異被公認(rèn)是抗擊腫瘤的關(guān)鍵。美國國立衛(wèi)生研究院在2006年啟動(dòng)了一項(xiàng)名為“癌癥基因組圖集”（The Cancer Genome Atlas，TCGA）的項(xiàng)目，通過該項(xiàng)目的實(shí)施，已在肺癌、乳腺癌等50種癌癥的上萬個(gè)樣本中發(fā)現(xiàn)了近1千萬種遺傳變異。目前學(xué)術(shù)界達(dá)成這樣一個(gè)共識,防治腫瘤的首要任務(wù)是了解腫瘤細(xì)胞的基因變異。
美國的國家癌癥研究所在2017開展了一次全國癌癥精確醫(yī)學(xué)問卷調(diào)查（National Survey of Precision Medicinein Cancer Treatment），其調(diào)查結(jié)果顯示：在參加調(diào)查的美國腫瘤醫(yī)生中，高達(dá)75.6%都在用“二代測序”技術(shù)（Next-Generation Sequencing，NGS）指導(dǎo)腫瘤治療，其中34.0%的醫(yī)生經(jīng)常使用NGS檢測來指導(dǎo)晚期難治性腫瘤患者的治療決定，29.1%的醫(yī)生通過NGS檢測決定腫瘤患者是否有資格進(jìn)行臨床試驗(yàn)，17.5%的醫(yī)生用NGS檢測來決定超適應(yīng)癥用藥。
基因測序目前已經(jīng)成為一個(gè)巨大的產(chǎn)業(yè)。根據(jù)美國聯(lián)合市場研究機(jī)構(gòu)在2017年年底發(fā)布的分析報(bào)告，2016年全球DNA測序市場約為52億美元，預(yù)計(jì)到2023年達(dá)到183億美元。顯然，腫瘤患者的基因檢測需求在這個(gè)測序市場占有重要的份額；例如，美國已經(jīng)有數(shù)百萬女性接受了抑癌基因BRCA1的基因變異檢測，以判定個(gè)體患乳腺癌或卵巢腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)程度。此外，越來越多的腫瘤基因檢測產(chǎn)品進(jìn)入了臨床應(yīng)用領(lǐng)域；例如，2017年12月，美國FDA批準(zhǔn)了首個(gè)腫瘤基因檢測盒上市；這款由波士頓一家生物公司“Foundation Medicine”制造的產(chǎn)品“Foundation One CDx”，通過對324 個(gè)特定的腫瘤基因的深度測序來檢測變異情況，從而對肺癌、乳腺癌、直腸癌和卵巢癌等四種常見的惡性腫瘤進(jìn)行早期診斷。
隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，基因測序技術(shù)也正在發(fā)生著重大的改進(jìn)。由于NGS技術(shù)的測定序列“讀長”較短，通常在200-300bp；研究者又開發(fā)了第三代測序技術(shù)，其“讀長”平均能達(dá)到10Kb以上。研究者利用第三代測序技術(shù)能夠進(jìn)一步揭示出腫瘤細(xì)胞基因組的變異特征和復(fù)雜性。例如在一項(xiàng)針對乳腺癌細(xì)胞系的測序工作中，作者利用第三代測序技術(shù)鑒定出17313個(gè)長度大于50bp的基因組結(jié)構(gòu)變異，包括插入、缺失、重復(fù)、倒位和其它特殊變異類型；而用NGS技術(shù)只檢測到了4174個(gè)基因組結(jié)構(gòu)變異[1]。可見第三代測序技術(shù)在基因組結(jié)構(gòu)變異檢測上具有更高的靈敏度與準(zhǔn)確度。
雖然研究者利用先進(jìn)的測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞中大量的基因變異，但是研究者對這些基因變異的生物學(xué)意義或在腫瘤的發(fā)生發(fā)展的病理作用方面仍知之甚少。例如研究者已經(jīng)在與乳腺癌或卵巢癌高度相關(guān)的抑癌基因BRCA1的13個(gè)外顯子上發(fā)現(xiàn)了近4千種單核苷酸變異（Single-nucleotide variants，SNVs），但大部分SNV的生物學(xué)含義或者在癌變中的作用并不是很清楚。不久前研究者采用CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)系統(tǒng)性地評估了整個(gè)BRCA1的外顯子序列上幾乎所有的SNV，鑒定出400多個(gè)SNV屬于非功能性錯(cuò)義突變（non-functional missense），同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了能夠抑制BRCA1表達(dá)的近300個(gè)SNV[2]?？梢哉J(rèn)為，確定基因變異在腫瘤中的作用依然是當(dāng)前基因檢測領(lǐng)域的主要挑戰(zhàn)。
需要指出的是，即使知道了腫瘤細(xì)胞里基因突變的作用或功能，也并不就意味著能夠給患者帶來益處。一項(xiàng)對5千多例非小細(xì)胞肺癌患者的基因檢測方式與生存率的相關(guān)性研究揭示，那些接受了30種基因以上的“廣譜基因”檢測的患者與只接受了單純的EGFR/ALK檢測的患者在12個(gè)月生存率上沒有顯著差異[3]。研究者發(fā)現(xiàn)，除了針對EGFR/ALK相關(guān)的靶向治療之外，在攜帶其他類型基因突變的患者中只有4.5%的人得到了相應(yīng)的靶向治療[3]。換句話說，檢測到了有臨床意義的突變不等于獲得了有效的治療藥物。當(dāng)前的基因檢測能力已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過人們研發(fā)靶向藥物的能力。
追蹤腫瘤動(dòng)態(tài)變化的利器：液體活檢
腫瘤最具挑戰(zhàn)性的特點(diǎn)除了高度異質(zhì)性之外就是高度可變性，即腫瘤細(xì)胞隨著病程或者治療過程時(shí)刻發(fā)生著各種各樣的變化。這個(gè)特點(diǎn)使得傳統(tǒng)的病理診斷或者影像診斷難以滿足治療腫瘤的需求，迫切需要一個(gè)能夠無創(chuàng)地動(dòng)態(tài)跟蹤腫瘤細(xì)胞變化的檢測技術(shù)。液體活檢技術(shù)就是一個(gè)用來滿足這種需求的檢測技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)可能是近年來在臨床上,尤其在腫瘤診治領(lǐng)域發(fā)展最快的檢驗(yàn)方法，曾被《麻省理工科技評論》評選為“2015年十大突破技術(shù)”。該項(xiàng)技術(shù)通過非侵入性方式檢測血液或尿液等體液中特定的生物標(biāo)志物，從而對癌癥等疾病做出相應(yīng)的診斷。目前腫瘤液體活檢的分析重點(diǎn)是血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）、循環(huán)腫瘤DNA （circulating tumor DNA，ctDNA）、 以及腫瘤細(xì)胞分泌的含有核酸、蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的囊泡狀外泌體（exosome）[4]。
對血液中的CTC和ctDNA進(jìn)行檢測是目前臨床應(yīng)用中最常見的液體活檢形式，尤其是ctDNA作為監(jiān)測腫瘤發(fā)生發(fā)展過程和藥物響應(yīng)的生物標(biāo)志物具有巨大的潛力。首先，通過對ctDNA的分析能夠提供對腫瘤基因組的綜合性信息以及找到往往在病理組織活檢中無法發(fā)現(xiàn)的體細(xì)胞突變，從而可以用于判斷腫瘤對藥物的敏感性或耐藥性，如從非小細(xì)胞肺癌患者的ctDNA中檢測到EGFR基因突變就可以用于指導(dǎo)臨床用藥。此外，通過對ctDNA的深度測序可以發(fā)現(xiàn)只在部分腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)的基因突變，從有助于解決腫瘤組織的內(nèi)部異質(zhì)性問題。
雖然液體活檢技術(shù)在臨床上得到迅速的推廣，但是該方法的臨床有效性并沒有得到很好的研究。美國臨床腫瘤學(xué)會和美國病理醫(yī)師學(xué)會對已經(jīng)發(fā)表的1338篇臨床關(guān)于ctDNA檢測的論文從分析有效性（analytical validity）、臨床有效性（clinical validity）和臨床實(shí)用性（clinical utility）三個(gè)方面進(jìn)行了系統(tǒng)地分析[5]。該項(xiàng)分析指出，目前發(fā)表的與ctDNA分析有效性相關(guān)的研究都是通過比較腫瘤組織和血漿中致病突變的一致性而得出結(jié)論，但實(shí)際上有很多生物學(xué)因素會影響到這種一致性；此外，ctDNA檢測到的陽性結(jié)果可以用于指導(dǎo)臨床治療，但檢測結(jié)果為陰性的患者仍然需要做腫瘤組織檢測，因?yàn)檫@類陰性結(jié)果的病人在組織病理檢測中可能是陽性結(jié)果。盡管當(dāng)前研究者很看重ctDNA的檢測潛力，但是在付諸日常臨床實(shí)踐時(shí)尚需要更多的臨床有效性證據(jù)”[5]。
液體活檢技術(shù)除了關(guān)注血液中的CTC和ctDNA之外，還涉及到了血液中RNA和蛋白質(zhì)等其它組分。血液蛋白質(zhì)在過去的臨床實(shí)踐中已經(jīng)被視為重要的生物標(biāo)志物來源，其中就有數(shù)十種腫瘤抗原或腫瘤分泌蛋白被廣泛用于診斷腫瘤發(fā)生或判斷治療效果和預(yù)后；近年來研究人員利用蛋白質(zhì)組技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展出了針對血液蛋白質(zhì)的液體活檢技術(shù)[6]。顯然，如何把血液中各種組分充分用于腫瘤液體活檢是研究者需要認(rèn)真考慮的問題。
腫瘤的分子分型：基于生物標(biāo)志物的兩種策略
傳統(tǒng)的腫瘤分類是基于解剖位置和病理性狀，屬于“粗放型”。由于腫瘤存在高度的異質(zhì)性，相似病理形態(tài)的腫瘤往往會表現(xiàn)出不同的臨床癥狀和不同的藥物響應(yīng)。隨著精確醫(yī)學(xué)的出現(xiàn)，研究者逐漸將基因和蛋白質(zhì)等生物大分子作為腫瘤分類的基礎(chǔ)。而分子分型的結(jié)果也在抗腫瘤藥物的研發(fā)中起到了重要的作用。例如，在原創(chuàng)藥Larotrectinib（原肌球蛋白受體激酶TRK的小分子抑制劑）的臨床試驗(yàn)中，入選的患者涉及到13種不同的實(shí)體瘤類型，但每個(gè)患者都有一個(gè)共同的分子標(biāo)志物——TRK基因的融合變異。
腫瘤細(xì)胞的基因變異信息目前是腫瘤分子分型最常用的分子標(biāo)志物；美國在啟動(dòng)“癌癥基因組圖集”（TCGA）項(xiàng)目時(shí)，從其名稱就可以看到是把腫瘤的分類目標(biāo)定在腫瘤細(xì)胞的基因組測序。但是，研究者很快就認(rèn)識到，單一的基因變異分子特征很難應(yīng)用于大部分癌癥類型。美國國家癌癥研究所（NCI）TCGA項(xiàng)目尚在進(jìn)行中又啟動(dòng)了一個(gè)針對腫瘤蛋白質(zhì)組的項(xiàng)目“the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium” (CPTAC)，不僅要獲得腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，而且要把基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)整合在一起進(jìn)行分析；研究者為此專門創(chuàng)造了一個(gè)詞“蛋白質(zhì)組-基因組學(xué)”（proteogenomics）。該項(xiàng)目的第一篇研究論文于2014年發(fā)表。在此項(xiàng)研究中，研究者首先把已經(jīng)被TCGA進(jìn)行過基因組測序的95個(gè)人類結(jié)直腸癌樣本做了蛋白質(zhì)組分析，然后將這些蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)和對應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，進(jìn)而更完整地揭示了這些腫瘤細(xì)胞的分子特性[7]。
隨著研究工作的深入，人們發(fā)現(xiàn)不同類型的生物大分子乃至其化學(xué)修飾在腫瘤鑒定和分類中都有著特定的價(jià)值，例如不久前發(fā)表的一項(xiàng)工作，利用改進(jìn)的液體活檢技術(shù)分析了血液中游離DNA（Cell-freeDNA, cfDNA）的甲基化信息，成功地進(jìn)行了早期腫瘤檢測并作了正確的分類[8]。
顯然，要實(shí)現(xiàn)腫瘤的精確分子分型，并用來指導(dǎo)個(gè)性化抗腫瘤藥物的研發(fā)，研究者必須改變那種依賴于單一類型生物標(biāo)志物乃至單個(gè)分子標(biāo)志物的簡單化思路，發(fā)展基于多個(gè)生物標(biāo)志物指標(biāo)的整合型評估技術(shù)，通過建立特定的評估模型來確定不同指標(biāo)之間的權(quán)重分配和進(jìn)行多指標(biāo)相互關(guān)聯(lián)分析，從而能夠確定個(gè)體患者的腫瘤分子特征以及預(yù)測其可能的藥物響應(yīng)情況。例如，TCGA項(xiàng)目的研究者在腫瘤分子分型方面，不僅利用了腫瘤細(xì)胞基因組序列的信息，而且還整合了相關(guān)的染色體非整倍性、DNA甲基表達(dá)譜、基因表達(dá)譜、microRNA表達(dá)譜和蛋白質(zhì)表達(dá)譜等數(shù)據(jù)，從而將傳統(tǒng)分類確定的33種腫瘤類型按照這種多組學(xué)整合的分子分型方法分為了28種類型[9]。
腫瘤分子分型的目標(biāo)，不僅是要找出具有相同病理形態(tài)的腫瘤的不同分子特征，而且還要提煉出不同病理形態(tài)的特定類型腫瘤的共同分子特征，即構(gòu)造一種稱為“泛腫瘤”（pan-cancer）的類型。不久前，美國研究人員采集了年齡20歲或以下的6種白血病和實(shí)體瘤的青少年腫瘤（paediatric cancers）近1千7百例樣本，檢測了其全基因組、全外顯子組和轉(zhuǎn)錄組序列，發(fā)現(xiàn)了一系列青少年腫瘤基因組所共有的特征，如在這些樣本中找到了142個(gè)驅(qū)動(dòng)基因，其中只有45%能夠在成人各種類型的腫瘤中找到[10]。又例如，研究者收集了卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、子宮肌瘤和乳腺癌共2千5百多例樣本，對這些樣本的基因組、表觀遺傳組、轉(zhuǎn)錄組以及蛋白質(zhì)組等多組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了整合，從而發(fā)現(xiàn)了16種與臨床相關(guān)的分子特征，在此基礎(chǔ)上對泛婦科腫瘤進(jìn)行了綜合分子分型，得到了與預(yù)后和靶向治療顯著相關(guān)的5種分子亞型[11]。
由此可以看出腫瘤分子分型的兩個(gè)主要策略：基于特定分子標(biāo)志物的“跨瘤種”分子分型，以及基于多組學(xué)數(shù)據(jù)整合的“泛腫瘤”分子分型。前者注重不同腫瘤類型間的分子個(gè)性特征，后者注重具有特定生物學(xué)共性（如“青少年腫瘤”或“婦科腫瘤”）的不同腫瘤類型間的分子綜合信息。二者都超越了基于組織病理形態(tài)特征的傳統(tǒng)腫瘤分類，從分子層面揭示出各種腫瘤之間的內(nèi)在聯(lián)系。
參考文獻(xiàn)
[1] Nattestad M, Goodwin S, Ng K, Baslan T, et al. Complex rearrangements and oncogene amplifications revealedby long-read DNA and RNA sequencing of a breast cancer cell line. Genome Res., 2018, 28:1126-1135.
[2] Findlay G M, Daza R M, MartinB, et al.Accurate functionalclassification of thousands of BRCA1 variants with saturation genome editing. Nature, 2018, 562:217-222.
[3] Presley C J, Tang D, Soulos P R,etal. Association of broad-based genomic sequencing with survival among patientswith advanced non–small cell lung cancer in the community oncology setting. JAMA, 2018, 320:469-477.
[4] Heitzer E, Haque I S, Roberts C E S,Speicher M R. Current and future perspectives of liquid biopsiesin genomics-driven oncology. Nat Rev Genet, 2019, 20:71-88.
[5] Merker J D, Oxnard G R,Compton C, et al. Circulating tumor DNAanalysis in patients with cancer: American Society of Clinical Oncology andCollege of American Pathologists joint review. J Clin Oncol, 2018,36:1631-1641.
[6] Kim Y, Jeon J, Mejia S, et al.Targeted proteomics identifies liquid-biopsy signatures for extracapsularprostate cancer. Nat. Communi, 2016, 7:11906.
[7] Zhang, B, Wang J, Wang X J, et al. Proteogenomic characterization of humancolon and rectal cancer. Nature 2014: 513:382-387.
[8] Shen SY, Singhania R, Fehringer G, et al. Sensitive tumourdetection and classification using plasma cell-free DNA methylomes. Nature,2018, 563:579-583.
[9] Hoadley K A, Yau C, Hinoue T,et al. Cell-of-origin patterns dominate the molecular classification of 10,000tumors from 33 types of cancer. Cell, 2018, 173:291-304.
[10] Ma X T, Liu Y,Liu Y L, et al. Pan-cancer genome andtranscriptome analyses of 1,699 paediatric leukaemias and solid tumours.Nature, 2018, 555:371-376.
[11] Berger A C, Korkut A, Kanchi R S, et al. Acomprehensive pan-cancer molecular study of gynecologic and breast cancers. Cancer Cell, 2018, 33: 690-705.
歡迎個(gè)人轉(zhuǎn)發(fā)，公眾號和報(bào)刊等轉(zhuǎn)載請聯(lián)系作者授權(quán)
