腫瘤早期診斷是有效提高腫瘤預(yù)后的最重要手段之一。目前采用的影像、內(nèi)鏡、腫瘤標(biāo)志物等進(jìn)行腫瘤早期篩查方式的敏感性仍不夠理想。液體活檢對(duì)檢出極微量的腫瘤來源核酸等標(biāo)志物具有很高的敏感性，可應(yīng)用于腫瘤早期乃至超早期篩查，未來市場(chǎng)潛力巨大。

一、我國腫瘤防治現(xiàn)狀

根據(jù)2018年《柳葉刀》上的全球腫瘤生存趨勢(shì)監(jiān)測(cè)報(bào)告顯示，我國整體腫瘤5年生存率為36.0%，遠(yuǎn)低于美國的64.0%。其中主要原因很可能是我國居民腫瘤早篩觀念較低，60%～80%的患者在確診時(shí)已到了中晚期，錯(cuò)過了腫瘤治療的最佳時(shí)期。腫瘤病人生存率隨著時(shí)間的推移是逐漸下降的，如果把診斷和治療從III期推移到I、II期，那么腫瘤的死亡率起碼可以降低一半。

2018年我國政府工作報(bào)告中提及，今后針對(duì)腫瘤發(fā)病高危人群，以及有明確證據(jù)證明通過篩查早診早治，明顯降低發(fā)病和死亡的高發(fā)癌癥病種，國家將加大資金投入，在醫(yī)保以及新農(nóng)合中設(shè)立專項(xiàng)資金進(jìn)行早期篩查，真正實(shí)現(xiàn)關(guān)口前移，預(yù)防為主。

一、液體活檢應(yīng)用于腫瘤早篩的潛力和挑戰(zhàn)

（一）當(dāng)前腫瘤篩查和診斷方式應(yīng)用于腫瘤早篩存在局限性

腫瘤的篩查和診斷目前主要依靠?jī)?nèi)鏡、影像學(xué)檢測(cè)和腫瘤標(biāo)志物等手段，但普遍存在局限性，敏感度不夠理想。內(nèi)鏡往往為侵入式操作，對(duì)病人體質(zhì)要求較高；影像學(xué)手段通常具有輻射性，且對(duì)早期腫瘤的識(shí)別力較低；腫瘤標(biāo)記物方法是測(cè)量腫瘤組織在生長(zhǎng)過程中分泌、排出到血液中的蛋白質(zhì)含量，但該方法的假陽性和假陰性的概率均較高。

（二）液體活檢有望實(shí)現(xiàn)腫瘤早期檢測(cè)，市場(chǎng)容量巨大，但敏感性和特異性有待提高

研究表明，在影像檢驗(yàn)顯示出明顯的腫瘤發(fā)病跡象前，早期患者血液中可能已經(jīng)出現(xiàn)CTC、ctDNA，也就是說通過CTC檢測(cè)和ctDNA檢測(cè)可能實(shí)現(xiàn)腫瘤早篩。

液體活檢采用高通量測(cè)序、PCR等手段,對(duì)檢出極微量的腫瘤來源核酸等標(biāo)志物具有很高的敏感性，因此可以用于腫瘤的早期乃至超早期篩查。大多數(shù)液體活檢的對(duì)象是血液樣品，容易實(shí)現(xiàn)對(duì)多種腫瘤的同步覆蓋，從而大大提高早篩效率并降低成本。

（三）液體活檢在腫瘤早篩領(lǐng)域有望帶來一個(gè)潛力巨大的藍(lán)海市場(chǎng)

根據(jù)美國國家腫瘤中心（NCI）指南，目前僅有乳腺癌、宮頸癌和結(jié)直腸癌有NCI推薦的診斷手段，但是沒有一個(gè)液體活檢手段，其他腫瘤類型沒有NCI指南推薦的適合篩查的檢測(cè)手段。

由于臨床上極大的未滿足需求以及液體活檢技術(shù)的優(yōu)越性，液體活檢在腫瘤早篩領(lǐng)域有望帶來一個(gè)潛力巨大的藍(lán)海市場(chǎng)。在2015年底的時(shí)候，JP摩根和高盛對(duì)液體活檢市場(chǎng)就做了相應(yīng)預(yù)測(cè)，其中早篩的占比是最大的。

圖1 不同腫瘤患者的篩查和診斷手段

（四）液體活檢存在技術(shù)局限性，其分析效度和臨床有效性有待確

雖然液體活檢在腫瘤早篩中的應(yīng)用非常有前景，但是目前還沒有成熟的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。液體活檢早篩技術(shù)既需要具有高度的敏感性，用于檢測(cè)由癌前病變或早期腫瘤釋放的痕量cfDNA或其他物質(zhì)；也需要具有高度的特異性，可以最大限度地減少大量未受影響的人群接受篩查時(shí)的假陽性結(jié)果。

圖2 腫瘤篩查和診斷手段的比較

二、基于液體活檢技術(shù)的腫瘤早篩檢測(cè)對(duì)象

基于液體活檢技術(shù)所衍生出來的早篩檢測(cè)對(duì)象主要包括“循環(huán)DNA”、“循環(huán)RNA”和“循環(huán)蛋白”，其中“循環(huán)DNA”占主導(dǎo)，以甲基化最受青睞。

（一）“循環(huán)DNA”層面

針對(duì)“循環(huán)DNA”，一方面可以通過高通量測(cè)序技術(shù)來檢測(cè)腫瘤中特有的堿基突變、拷貝數(shù)變異以及基因組結(jié)構(gòu)變異等信息，還可以通過表觀遺傳學(xué)的相關(guān)檢測(cè)手段來發(fā)現(xiàn)腫瘤特有的甲基化模式、組蛋白修飾模式等。起初，cfDNA層面的液體活檢技術(shù)主要基于堿基突變，然而其用于腫瘤早期檢測(cè)時(shí)存在一些難以回避的挑戰(zhàn)。首先，由于許多腫瘤類型在一些基因如KRAS、BRAF或TP53中具有共同突變，因此在進(jìn)行陽性液體活檢測(cè)試后將腫瘤定位于特定器官可能是困難的。此外，良性病變可能擁有在腫瘤中發(fā)現(xiàn)的相同突變，并有潛力將cfDNA排入血液循環(huán)中。cfDNA中可檢測(cè)到的突變通過“未定潛能的克隆性造血（clonal hematopoiesis of indeterminate potential, CHIP）”過程，也可能來源于骨髓中異常且通常是良性的克隆群體。CHIP的頻率隨年齡呈指數(shù)增長(zhǎng)，其在70歲以上的人中比率超過10%。因此，CHIP是cfDNA中可檢測(cè)到的多種突變的一種常見來源，對(duì)cfDNA突變檢測(cè)的應(yīng)用構(gòu)成了重大挑戰(zhàn)。出于這個(gè)原因，除了cfDNA中的簡(jiǎn)單突變檢測(cè)之外，腫瘤相關(guān)的病毒序列和DNA甲基化檢測(cè)也正在被探究用于腫瘤早篩。

盧煜明教授研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)血漿樣本EBV病毒的DNA分析有助于早期無癥狀鼻咽癌的篩查。隨后，他們還對(duì)EB病毒的cfDNA檢測(cè)方法進(jìn)行了改進(jìn)。這種改進(jìn)方法可以增強(qiáng)陽性預(yù)測(cè)值，在鼻咽癌篩查中表現(xiàn)出優(yōu)越的性能；同時(shí)，該方法也降低了檢測(cè)成本，可以在單一時(shí)間點(diǎn)抽取一次血樣，將有助于進(jìn)行鼻咽癌的大規(guī)模篩查。

DNA甲基化有足夠的潛力作為腫瘤的生物標(biāo)志物，用于篩查、預(yù)后以及療效監(jiān)測(cè)。在表觀遺傳中，最常見的甲基化修飾就是胞嘧啶甲基化和羥甲基化，產(chǎn)生5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）。已有研究表明，通過血液cfDNA的5mC和5hmC檢測(cè)，找出腫瘤與非癌的差異，可以對(duì)腫瘤進(jìn)行輔助診斷。

2017年3月，張鹍教授研究團(tuán)隊(duì)于《自然·遺傳學(xué)》雜志上公布了世界首創(chuàng)的高通量甲基化無創(chuàng)檢測(cè)新技術(shù)，該技術(shù)不僅可以在腫瘤早期進(jìn)行檢測(cè)，而且能夠?qū)崿F(xiàn)組織定位。隨后，張康教授和徐瑞華教授研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)通過檢測(cè)少量血液中ctDNA特定位點(diǎn)甲基化水平，可以對(duì)肝癌進(jìn)行早期診斷及療效和預(yù)后預(yù)測(cè)。這種新方法與原來常規(guī)的甲胎蛋白檢測(cè)相比，將肝癌的漏診率降低一半以上，幫助醫(yī)生發(fā)現(xiàn)更多的早期肝癌患者。此外，何川教授研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)通過比較健康人和肝癌患者的5hmC在全基因組范圍DNA中的分布和含量，找出差異5hmC信號(hào)模式來作為腫瘤標(biāo)志物，可實(shí)現(xiàn)早期腫瘤檢測(cè)。

（二）“循環(huán)RNA”層面

理論上來講，miRNA、lncRNA、mRNA都可以作為腫瘤特異性的標(biāo)記物應(yīng)用在臨床。其中，mRNA在鑒定腫瘤特異性基因表達(dá)譜中最為常用，但胞外mRNA在血液中難以檢測(cè)到，主要原因是其大多數(shù)會(huì)被RNA酶快速降解。相比之下，miRNA在血液中以核酸-蛋白復(fù)合物形式存在或包被于外泌體中，不易被降解。大量研究發(fā)現(xiàn)，特定血清miRNA的表達(dá)高低可用于肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、肝癌等常見腫瘤的早期篩查、診斷和療效跟蹤。而且，將十幾乃至數(shù)十個(gè)miRNA編為一組（即一個(gè)panel），通過一系列算法和計(jì)分機(jī)制可提高檢測(cè)的靈敏度和特異性。lncRNA是一種長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其在血液中也很穩(wěn)定，并受內(nèi)源RNA酶的保護(hù)。相比miRNA，我們目前對(duì)lncRNA的生物學(xué)特性及功能了解的還很少，但循環(huán)lncRNA未來也很可能成為用于腫瘤早期篩查及診斷的生物標(biāo)志物。

（三）“循環(huán)蛋白”層面

蛋白質(zhì)組學(xué)在早期腫瘤檢測(cè)中的應(yīng)用潛力已經(jīng)探索了很長(zhǎng)時(shí)間，但基于蛋白質(zhì)的檢測(cè)仍未達(dá)到臨床所需的敏感度和特異性。目前，前列腺特異性抗原（PSA）是唯一廣泛應(yīng)用于腫瘤早篩的腫瘤標(biāo)志物，而且其合理使用仍然處于爭(zhēng)論之中。除了游離形式之外，血液中的蛋白質(zhì)還存在于外泌體中。例如，細(xì)胞表面糖蛋白GPC1在腫瘤細(xì)胞來源的外泌體中特異性富集，有望作為胰腺癌早期的診斷生物標(biāo)識(shí)。近些年，蛋白質(zhì)組學(xué)和肽組學(xué)的最新進(jìn)展顯露了蛋白質(zhì)未來在腫瘤液體活檢中所發(fā)揮的重要價(jià)值。

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圖3 腫瘤早篩的檢測(cè)對(duì)象

未來，用于腫瘤早篩的液體活檢策略很可能會(huì)融合不同種類的檢測(cè)對(duì)象，綜合不同的技術(shù)手段。一項(xiàng)名為CancerSEEK的血液檢測(cè)方法通過測(cè)量16個(gè)基因的ctDNA以及8個(gè)蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，可以用于8種腫瘤的早期檢測(cè)，而且能夠確定腫瘤起源組織。

面對(duì)腫瘤早篩，我們當(dāng)前需要做的應(yīng)是盡可能的尋找到腫瘤早期形成及演變的“先驗(yàn)知識(shí)”即腫瘤早期時(shí)的“蛛絲馬跡”，以此為起點(diǎn)不斷優(yōu)化?；谝后w活檢的方式可能很難以100%的特異性和敏感度實(shí)現(xiàn)腫瘤早期檢測(cè)，也可能不存在能早期檢測(cè)所有腫瘤的液體活檢方法。

三、ctDNA甲基化的檢測(cè)技術(shù)

（一）亞硫酸氫鹽測(cè)序是DNA甲基化檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)

DNA甲基化檢測(cè)由于具有信號(hào)特異性強(qiáng)、定位腫瘤等優(yōu)勢(shì)，目前已經(jīng)得到了科研人員、企業(yè)家和投資者的青睞。當(dāng)前使用的DNA甲基化檢測(cè)方法大都需要亞硫酸氫鹽處理。亞硫酸氫鈉處理后，未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而發(fā)生甲基化的胞嘧啶不變，通過甲基化特異性PCR、甲基化芯片或者測(cè)序可以檢測(cè)DNA甲基化位點(diǎn)。

由于血漿cfDNA的豐度低且碎片化程度高，限制了大部分血漿甲基化特異性PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用，相關(guān)檢測(cè)研究也存在較大的挑戰(zhàn)。基于芯片和下一代測(cè)序（NGS）的高通量技術(shù)為DNA甲基化的廣泛檢測(cè)提供了技術(shù)平臺(tái)。甲基化芯片主要有450K和850K兩款，它們基于熒光定量來鑒定DNA甲基化，和測(cè)序的結(jié)果吻合度較好，但問題在于檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)較少，且現(xiàn)階段的成本也不便宜。由于NGS技術(shù)的快速發(fā)展，其在ctDNA的甲基化檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用。

根據(jù)基因組覆蓋范圍，基于NGS的甲基化檢測(cè)技術(shù)可分為覆蓋所有甲基化位點(diǎn)的WGBS（Whole genome bisulfite sequencing）技術(shù)，覆蓋~10%甲基化位點(diǎn)的RRBS（Reducedrepresentation bisulfite sequencing）技術(shù)和甲基化捕獲技術(shù)。WGBS可以覆蓋所有甲基化位點(diǎn)，還能夠配合靶向技術(shù)檢測(cè)低頻甲基化信號(hào)，檢測(cè)成本也最高。RRBS在亞硫酸氫鹽處理前，使用MspI（該酶的酶切位點(diǎn)為CCGG）酶切對(duì)樣本進(jìn)行處理，去除低CG含量DNA片段，從而使用較小的數(shù)據(jù)量富集到盡可能多的包含CpG位點(diǎn)的DNA片段（甲基化的DNA通常富含CpG位點(diǎn)）。RRBS在三種NGS技術(shù)中成本最低，但測(cè)序數(shù)據(jù)不夠穩(wěn)定。甲基化捕獲技術(shù)使用雜交探針富集甲基化相關(guān)片段后再測(cè)序，成本介于WGBS和RRBS之間，數(shù)據(jù)較RRBS更穩(wěn)定，目前已經(jīng)開發(fā)有商業(yè)化的試劑盒，如Roche SeqCap Epi CpGiant Kit。

最初的WGBS技術(shù)使用傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽處理前建庫方法（Pre-BS），然而亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化會(huì)導(dǎo)致~90%的DNA模板丟失，從而造成建庫起始量高，有效數(shù)據(jù)量低。因此，在文庫構(gòu)建流程中，目前的WGBS大都使用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后建庫策略（Post-BS），該策略能夠有效的規(guī)避亞硫酸氫鹽處理對(duì)預(yù)文庫的損傷，提高模板利用率，降低建庫起始量，同時(shí)提高測(cè)序文庫豐富度，增加有效測(cè)序數(shù)據(jù)。不過，在Post-BS建庫時(shí)，單鏈DNA在連接接頭時(shí)的效率較低，目前已有多種方法在嘗試攻克單鏈建庫這個(gè)難題。

（二）亞硫酸氫鹽測(cè)序存在限制，BS-free技術(shù)不斷涌現(xiàn)

目前，亞硫酸氫鹽測(cè)序是DNA甲基化檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但這種測(cè)序方法仍有極大的限制，由于亞硫酸氫鹽對(duì)DNA的降解率高達(dá)84%-96%，在處理有限的樣本時(shí)（如血液中的cfDNA），亞硫酸氫鹽測(cè)序?qū)⒆兊梅浅＞哂刑魬?zhàn)性。此外，亞硫酸氫鹽測(cè)序是間接檢測(cè)5mC和5hmC。由于未修飾的胞嘧啶約占人類基因組總胞嘧啶的95%。將所有未修飾的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶會(huì)嚴(yán)重降低序列復(fù)雜性，導(dǎo)致測(cè)序質(zhì)量差，定位效率低，基因組覆蓋不均勻和測(cè)序成本增加。因此，無需亞硫酸氫鹽處理的甲基化檢測(cè)技術(shù)（BS-free）一直是研究者夢(mèng)寐以求“神器”。

加拿大多倫多瑪格麗特公主腫瘤中心的Shu Yi Shen等研究者開發(fā)了一種名為“甲基化游離DNA免疫共沉淀測(cè)序（cfMeDIP-seq）”方法。該方法將免疫共沉淀技術(shù)與高通量測(cè)序結(jié)合，通過對(duì)cfDNA中的甲基化DNA片段進(jìn)行特異性富集，提高檢測(cè)效率。同時(shí)結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)構(gòu)建一種分類器，能夠識(shí)別血液樣本中腫瘤來源的DNA，并確定癌種。

同年，美國賓夕法尼亞大學(xué)研究人員報(bào)道了一種利用酶學(xué)轉(zhuǎn)化原理替換亞硫酸氫鹽化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法——ACE-seq，該方法通過引入一種被稱為APOBEC的脫氨酶，可以有效區(qū)分胞嘧啶修飾狀態(tài)，其所能達(dá)到的效果與使用亞硫酸氫鹽處理相似，但不會(huì)對(duì)DNA造成損傷。

2019年2月25日，牛津大學(xué)路德維格腫瘤研究所宋春嘯等研究者發(fā)現(xiàn)了一種新的DNA甲基化測(cè)序方法：TET輔助吡啶硼烷測(cè)序（TET-assisted pyridine boranesequencing，TAPS）。該方法首先利用TET酶將5mC和5hmC轉(zhuǎn)化為第三種修飾，然后再利用化學(xué)反應(yīng)將其轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，就可以通過普通測(cè)序儀直接測(cè)序。目前，此團(tuán)隊(duì)正在改進(jìn)該方法，使其用于檢測(cè)單細(xì)胞和血液中的ctDNA，以開發(fā)微創(chuàng)、無創(chuàng)的腫瘤診斷技術(shù)。

圖4 DNA甲基化的檢測(cè)技術(shù)

四、腫瘤早篩的市場(chǎng)布局情況

腫瘤早期篩查作為腫瘤預(yù)防的重要手段，是未來醫(yī)學(xué)和檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的方向，國內(nèi)外已有多家公司致力于腫瘤早篩，但大都處于起步階段，技術(shù)偏向甲基化產(chǎn)品以LDT形式為主。

據(jù)Piper Jaffray測(cè)算，2026年液體活檢在早期篩查領(lǐng)域的全球市場(chǎng)容量為150億美元。目前，國內(nèi)外已經(jīng)有多家公司將液體活檢技術(shù)應(yīng)用于腫瘤早篩，但多數(shù)處于起步階段，正在進(jìn)行檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)化、樣本的累積或者前瞻性臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證。在檢測(cè)對(duì)象方面，國內(nèi)外公司更偏向于循環(huán)DNA層面的甲基化標(biāo)志物。

大多數(shù)司開發(fā)的腫瘤早篩產(chǎn)品針對(duì)結(jié)直腸癌、肝癌和肺癌等常見的單一腫瘤類型，也有少數(shù)公司研發(fā)了泛癌種早篩產(chǎn)品，如萊盟君泰和思勤醫(yī)療。此外，市場(chǎng)上的產(chǎn)品大都以LDT的形式提供給終端客戶，僅少數(shù)產(chǎn)品獲得了原CFDA（現(xiàn)NMPA）或FDA批準(zhǔn)，且基本是基于糞便DNA檢測(cè)的腸癌篩查產(chǎn)品。

表1 國內(nèi)布局液體活檢腫瘤早篩公司

表2 國外布局液體活檢腫瘤早篩公司

五、小結(jié)

綜上所述，早期篩查作為腫瘤預(yù)防的重要手段，是未來醫(yī)學(xué)和檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的方向，國內(nèi)外已有多家公司布局腫瘤早篩市場(chǎng)，但大都處于起步階段，技術(shù)偏向甲基化產(chǎn)品以LDT形式為主。液體活檢具有無創(chuàng)、可重復(fù)性強(qiáng)、樣本獲取方便等優(yōu)點(diǎn)，有望實(shí)現(xiàn)腫瘤早期檢測(cè)，提高無癥狀高危人群的腫瘤早期檢出率,幫助臨床醫(yī)生把握腫瘤的最佳治療時(shí)機(jī),有效地提高患者的生存率。未來市場(chǎng)容量巨大。

但液體活檢也不是萬能，基于液體活檢的方式可能很難以100%的特異性和敏感度實(shí)現(xiàn)腫瘤早期檢測(cè)，也可能無法實(shí)現(xiàn)對(duì)所有腫瘤的全覆蓋早期檢測(cè)。以精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的要求與目標(biāo)來看，液體活檢的分析效度和臨床有效性有待確認(rèn)，未來技術(shù)上仍需進(jìn)行多方面的探索和突破，同時(shí)，業(yè)內(nèi)亟需建立、完善行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和市場(chǎng)監(jiān)管。

—END—

作者 | 木子鵬

責(zé)編 | 老姜

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一、液體活檢應(yīng)用于腫瘤早篩的潛力和挑戰(zhàn)

（一）當(dāng)前腫瘤篩查和診斷方式應(yīng)用于腫瘤早篩存在局限性

二、基于液體活檢技術(shù)的腫瘤早篩檢測(cè)對(duì)象