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在蛋白質(zhì)印跡法系列培訓(xùn)的第 4 課中，我們將說(shuō)明如何進(jìn)行熒光蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)。首先，我們會(huì)介紹如何進(jìn)行轉(zhuǎn)換、一些優(yōu)勢(shì)以及 IRDye? 二抗。然后,我們將介紹熒光蛋白質(zhì)印跡法的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方案。最后，我們將為您展示一些疑難解答提示，幫助您解決熒光蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)中遇到的問(wèn)題。

4.1

之前,您已經(jīng)很好地掌握了傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光(ECL)蛋白質(zhì)印跡，現(xiàn)在我們?yōu)槟榻B這一技術(shù)的熒光形式。熒光蛋白質(zhì)印跡克服了傳統(tǒng) ECL 的局限，擁有多項(xiàng)優(yōu)勢(shì)。

當(dāng)從 ECL 轉(zhuǎn)換到熒光時(shí),您需要牢記哪些問(wèn)題？以下是我們提出的要點(diǎn)。

1.為達(dá)到最佳信噪比，優(yōu)化一抗和二抗的濃度。通常情況下,您需要降低濃度。

2.使用自發(fā)熒光低的膜，否則在檢測(cè)信噪比和條帶定量時(shí)將遇到阻礙?？梢允褂玫蜔晒?PVDF 膜。

3.不同封閉緩沖液對(duì)一抗的影響不同。我們建議在 TBST 中加入 5% 脫脂牛奶。

4.盡量避免任何其他物質(zhì)沉淀到膜上從而產(chǎn)生熒光偽影——即使是鋼筆痕跡也會(huì)產(chǎn)生自發(fā)熒光，所以請(qǐng)使用鉛筆。

4.1. 不要使勁壓膜，因?yàn)殇h利的物體有時(shí)同樣會(huì)留下熒光偽影！

4.2. 處理膜時(shí)，為盡可能減少印跡上的偽影和指紋，請(qǐng)佩戴無(wú)粉丁腈手套。

5.盡管使用的大多數(shù)一抗耐光能力較強(qiáng)，且在正常的實(shí)驗(yàn)室照明下不會(huì)褪色，但為避免可能出現(xiàn)的光漂白現(xiàn)象，最好在黑暗條件下孵育膜。

6.避免洗脫肌動(dòng)蛋白或 β 微管蛋白等高豐度蛋白質(zhì)，因?yàn)樵诓挥绊懩て渌麉^(qū)域總蛋白質(zhì)的情況下，很難從膜上洗脫這些蛋白質(zhì)。

7.最后，如果上樣染料中要使用溴酚藍(lán)，我們建議確保染料前沿移動(dòng)到離待檢測(cè)的蛋白質(zhì)足夠遠(yuǎn)的位置，因?yàn)檫@種染料具有自發(fā)熒光的傾向。

7.1. 您可以改變凝膠濃度，確保染料前沿已通過(guò)您的目標(biāo)區(qū)域。

4.2

我們建議使用 IRDye? 偶聯(lián)的二抗進(jìn)行熒光蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)。這項(xiàng)技術(shù)除了具有多重檢測(cè)能力之外，IRDye? 二抗發(fā)出的信號(hào)與印跡中的靶蛋白數(shù)量成正比，可對(duì)靶蛋白進(jìn)行一定程度的定量。

圖 1.蛋白質(zhì)印跡法 - 山羊抗兔 IgG H&L(IRDye? 800CW)預(yù)吸附二抗 (ab216773)。全部泳道：稀釋度為 1/1000 的抗 NF-κB p65 抗體 (ab16502)。綠色：大小為 70 kDa 的抗 NF-κB p65 抗體(ab16502)。紅色：大小為 37 kDa 的抗 GAPDH 抗體 [6C5] - 上樣內(nèi)參對(duì)照(ab8245)。山羊抗小鼠 IgG H&L (IRDye? 680RD) ab216776。第 1 泳道：野生型 HAP1 細(xì)胞裂解物(20 μg)。第 2 泳道：NF-κB p65 敲除 HAP1 細(xì)胞裂解物 (20 μg)。第 3 泳道：HeLa 細(xì)胞裂解物 (20 μg)。第 4 泳道：A431 細(xì)胞裂解物(20 μg)。二抗,所有泳道：稀釋度為 1/10000 的山羊抗兔 IgG H&L(IRDye? 800CW) 預(yù)吸附二抗(ab216773)(山羊抗兔 IgG H&L (IRDye? 800CW)。在 MES 緩沖液系統(tǒng)中使用 4%-12% Bis-Tris 凝膠生產(chǎn)該印跡。合并信號(hào)(紅色和綠色)。在 200V 下跑膠 50 分鐘,然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,在 30V 條件下跑膠 70 分鐘。然后將膜封閉一小時(shí),之后在 4°C 的 ab16502 中孵育過(guò)夜。使用室溫下孵育 1 小時(shí)、稀釋度為 1/10,000 的山羊抗兔 IgG H&L(IRDye? 800CW)預(yù)吸附二抗(ab216773)檢測(cè)抗體結(jié)合,然后使用 Licor Odyssey CLx 進(jìn)行成像。

4.3

現(xiàn)在您已經(jīng)充分了解了熒光蛋白質(zhì)印跡以及由 ECL 轉(zhuǎn)換時(shí)的注意事項(xiàng),您可以在此查找完整熒光蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)方案。

熒光蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)方案包括獲得熒光蛋白質(zhì)印跡清晰條帶所需的封閉、抗體稀釋、孵育時(shí)間、清洗步驟與成像。包括從開(kāi)始到結(jié)束的完整步驟。

圖 2.用 Optiblot 熒光蛋白質(zhì)印跡試劑盒(ab133410)同時(shí)檢測(cè) EGFR 和磷酸化 EGFR。檢測(cè)出 EGF 導(dǎo)致 EGFR 磷酸化程度的增加。將 A431 細(xì)胞裂解物(第 1 泳道)與經(jīng)過(guò) EGF 處理的 A431 細(xì)胞裂解物(第 2 泳道)雜交,綠色通道(b)中檢出 EGFR 或紅色通道(c)中檢出磷酸化 EGFR。兩個(gè)通道在(a)中疊加。第 3 泳道：分子量標(biāo)記物。

?? 點(diǎn)擊此處,查看全部實(shí)驗(yàn)方案

4.4

蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)方案的全部步驟已介紹完畢,現(xiàn)在您可能發(fā)現(xiàn)您的實(shí)驗(yàn)需要做一些調(diào)整或進(jìn)行疑難解答。如仍有困難或任何不確定的問(wèn)題,您可以在我們的蛋白質(zhì)印跡提示和技巧列表中查找。