圖源：https://www.nottingham.ac.uk/

編者按

當(dāng)同一種類(lèi)的病毒導(dǎo)致的疫情再次出現(xiàn)時(shí)，人們難免疑惑：第二次疫情中的病毒究竟來(lái)自于哪里？它們是來(lái)自于無(wú)癥狀傳播等自然過(guò)程，還是來(lái)自于樣品泄漏等人為失誤？科學(xué)家有方法找出病毒來(lái)源的蛛絲馬跡嗎？本文以藍(lán)舌病毒為例介紹了尋找病毒來(lái)源的科學(xué)原理。

撰文 | 吳蕾

責(zé)編 | 錢(qián)文峰陳曉雪

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藍(lán)舌病毒（Bluetongue virus，BTV）是一種能引起藍(lán)舌病（Bluetongue disease，BT）的RNA病毒，主要感染反芻動(dòng)物，例如羊、牛、鹿等，其中以綿羊尤為易感 [1]。患病動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)高燒、流涎、面部和舌頭腫脹等癥狀，少數(shù)動(dòng)物的舌頭會(huì)呈藍(lán)色，這也是此病名稱(chēng)的由來(lái)。目前共發(fā)現(xiàn)了29個(gè)不同的BTV血清型 [2]，其中BTV-8在2006年于荷蘭、比利時(shí)、德國(guó)、盧森堡等國(guó)發(fā)現(xiàn)。這一血清型的病毒隨后在歐洲的十幾個(gè)國(guó)家發(fā)生了大流行，造成了多達(dá)數(shù)十億歐元的經(jīng)濟(jì)損失。2010年推行疫苗之后，疫情得到了有效的控制，隨后的五年中再無(wú)BTV-8的報(bào)道。

但在2015年，法國(guó)再次出現(xiàn)了BTV-8，并引發(fā)了第二次大流行。[3]

歐洲地區(qū)2006-2018年報(bào)告的BTV-8病例[3]，數(shù)據(jù)來(lái)自世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（World Organisation for Animal Health）。2009和2018年法國(guó)由于大流行而沒(méi)有向OIE提供包含位置信息的病例數(shù)據(jù)，因此這兩年的數(shù)據(jù)與其他年份不能進(jìn)行比較

為什么時(shí)隔五年BTV-8會(huì)再次暴發(fā)？來(lái)自于法國(guó)國(guó)家食品、環(huán)境及勞動(dòng)衛(wèi)生署的 Sailleau 等人認(rèn)為，此病毒在這五年間依然在牲畜和野生動(dòng)物中保持小范圍的持續(xù)傳播，但并不表現(xiàn)出明顯的癥狀（無(wú)癥狀感染動(dòng)物），因此未被注意到 [4]。英國(guó)格拉斯哥大學(xué)的 David J. Pascall 等人則對(duì)這一假說(shuō)進(jìn)行了檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)很可能并非如此。相關(guān)文章在2020年4月28日發(fā)表于 PLOS Biology [3]。

BTV-8被 “凍結(jié)” 的進(jìn)化

為了確定病毒之間的 “親緣” 關(guān)系，Pascall 等人首先根據(jù)基因組序列構(gòu)建了兩次疫情中總計(jì)164個(gè)BTV-8病毒的進(jìn)化樹(shù)。

BTV-8的進(jìn)化樹(shù)[3]

紫色為來(lái)自第一次疫情的樣品，橙色為來(lái)自第二次疫情的樣品；橫坐標(biāo)展示每個(gè)樣品與BTV-8祖先序列的遺傳距離，距離越大則進(jìn)化關(guān)系越遠(yuǎn)。

從該進(jìn)化樹(shù)中可以看出，第二次疫情中的樣品構(gòu)成了一個(gè)整體（單系群，monophyletic group），嵌在了第一次疫情的樣品之中。這表明引發(fā)第二次疫情的病毒具有單一的共同祖先，而且這個(gè)祖先來(lái)自于第一次疫情。這并不足以對(duì)病毒來(lái)源于自然過(guò)程還是人為失誤進(jìn)行區(qū)分：盡管這種單一起源的方式似乎更符合人為失誤導(dǎo)致少數(shù)病毒意外泄漏的猜測(cè)，但也有可能是因?yàn)闊o(wú)癥狀感染的動(dòng)物恰恰攜帶了該祖先病毒。

這一進(jìn)化樹(shù)的不尋常之處在于，來(lái)自于兩次疫情的樣品（紫色和橙色）之間的枝長(zhǎng)很短。進(jìn)化樹(shù)的枝長(zhǎng)能夠反映樣品之間的序列差異程度。自然情況下，病毒每次復(fù)制的時(shí)候都不可避免產(chǎn)生一些新的突變，這種突變積累的速率基本保持恒定（即分子鐘，詳見(jiàn)《缺乏早期樣品，還能追溯回病原體擴(kuò)散的第一天嗎？》），因此樣品之間基因組的差異能代表它們的分化時(shí)間。以此論文分析的時(shí)間段來(lái)看，第一次疫情的時(shí)間段為2006-2010年，第二次疫情的時(shí)間段為2015-2018年，中間相隔了5年。在自然狀態(tài)下，理論上兩次疫情樣本之間5年的差異，應(yīng)該明顯大于兩次疫情各自的內(nèi)部差異（3-4年）。然而在進(jìn)化樹(shù)中兩次疫情之間的枝長(zhǎng)（紅色標(biāo)出）短于每次疫情內(nèi)部的枝長(zhǎng)（紫色和橙色標(biāo)出），這與理論推斷并不一致，提示了第二次BTV-8疫情的非自然起源。

為了解第二次疫情的病毒起源于何時(shí)何地，Pascall 等人構(gòu)建了第二次疫情中BTV-8的祖先序列，發(fā)現(xiàn)此序列與第一次疫情中2007年8月采集于法國(guó)的一個(gè)樣品 BTV-8_FRA2007-3673 的序列最為相似——而第二次疫情最早就是在法國(guó)暴發(fā)的。隨后他們將這個(gè)祖先序列也納入數(shù)據(jù)集，利用分子鐘原理推斷第二次疫情病毒祖先在第一次疫情中存在的時(shí)間。

BTV-8樣品采集時(shí)間和其與祖先序列遺傳距離的關(guān)系[3]

在上面的圖中，橫坐標(biāo)表示樣本采集的時(shí)間，縱坐標(biāo)表示它們和兩次疫情所有BTV-8的共同祖先的遺傳距離。結(jié)果表明，第一次疫情（斜率為7.3×10^-4個(gè)突變每個(gè)位點(diǎn)每年，r²=0.81）和第二次疫情（斜率為6.9×10^-4個(gè)突變每個(gè)位點(diǎn)每年，r²=0.96）各自的時(shí)間段內(nèi)，和祖先序列的差異與時(shí)間接近線性關(guān)系——符合生物進(jìn)化的分子鐘假設(shè)。盡管2010-2015年間沒(méi)有BTV-8的報(bào)告，但是依然可以看出兩次疫情之間存在間斷，而且第二次疫情病毒的共同祖先在第一次疫情中對(duì)應(yīng)的出現(xiàn)時(shí)間為2008年3月末。換言之，在每次疫情的時(shí)間段內(nèi)，BTV-8的進(jìn)化過(guò)程都符合自然狀態(tài)；然而在2008年到2015年間，引發(fā)了第二次疫情的BTV-8的進(jìn)化過(guò)程卻仿佛被 “凍結(jié)” 了。

“凍結(jié)” 的進(jìn)化與第二次疫情中BTV-8的來(lái)源

前面已經(jīng)提到，自然界中的病毒在復(fù)制過(guò)程中會(huì)積累突變，時(shí)間越久積累的突變也就越多。然而第二次疫情中的BTV-8卻經(jīng)歷了長(zhǎng)達(dá)7年的進(jìn)化停滯，并不符合自然狀態(tài)下持續(xù)無(wú)癥狀傳播的假說(shuō)。那么是什么導(dǎo)致了病毒的進(jìn)化過(guò)程被 “凍結(jié)” 呢？

BTV不是反轉(zhuǎn)錄的RNA病毒（例如艾滋病毒），因此不太可能在宿主體內(nèi)沉默數(shù)年而不復(fù)制；另外，BTV的傳播需要昆蟲(chóng)宿主，并且無(wú)法在昆蟲(chóng)中長(zhǎng)期潛伏。排除了以上兩種可能后，Pascall 等人猜想2015年出現(xiàn)的第二次疫情可能是由于受到了BTV-8污染的冷凍材料被重新釋放到了自然環(huán)境。首當(dāng)其沖的假設(shè)是實(shí)驗(yàn)室泄漏——然而他們認(rèn)為這也不成立，因?yàn)楦鶕?jù)目前了解到的情況，在2010-2015年間法國(guó)并沒(méi)有實(shí)驗(yàn)室使用昆蟲(chóng)宿主開(kāi)展BTV的體內(nèi)研究。

值得注意的是，家畜飼養(yǎng)過(guò)程中存在一個(gè)獨(dú)特的暴露于冷凍病毒的風(fēng)險(xiǎn)——人工授精和胚胎移植技術(shù)，這一技術(shù)尤其被廣泛應(yīng)用于奶牛的繁育。已有研究表明，公牛的精液中可以檢測(cè)出BTV。這些病毒能夠感染母體，傳遞給胚胎 [5, 6] 并且在胚胎移植過(guò)程中傳播 [7]。雖然出口的公牛精液按規(guī)定必須進(jìn)行包括BTV在內(nèi)的各種病原體篩查，但這些法規(guī)并不適用于提供人工授精服務(wù)的本地公司。因此，作者推測(cè)，受到BTV-8污染的公牛冷凍精液或胚胎是BTV-8第二次疫情最可能的來(lái)源。不過(guò)，這只是排除了諸多其他可能性之后作者推測(cè)的最可能發(fā)生的情形。盡管數(shù)據(jù)支持BTV-8的進(jìn)化歷程受到了 “凍結(jié)”，究竟來(lái)源于哪種類(lèi)型的人為失誤還有待進(jìn)一步的實(shí)證研究。

結(jié) 語(yǔ)

如何判斷二次暴發(fā)的病毒是來(lái)自于無(wú)癥狀傳播等自然過(guò)程，還是來(lái)自于樣品泄漏等人為失誤？在BTV-8二次暴發(fā)的案例中，作者判斷來(lái)自于人為失誤。理由有二：首先是能夠在已有的數(shù)據(jù)庫(kù)中找到與之高度相似的序列；其次，冷凍大幅減緩了這些病毒的進(jìn)化。

歷史上，通過(guò)分析暴發(fā)的病毒序列找到其來(lái)源的案例并不少見(jiàn)。1977年，在前蘇聯(lián)和我國(guó)東北暴發(fā)的H1N1流感病毒與1950年流行株系的序列幾乎一致，不符合自然起源的規(guī)律，可能是由使用不合格的疫苗導(dǎo)致的[8]。2007年8月流行于英國(guó)的口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）與研究機(jī)構(gòu)的意外泄漏有關(guān)：通過(guò)基因組序列分析，Cottam等人發(fā)現(xiàn)這次疫情中的口蹄疫病毒來(lái)自于“FMDV O1 BFS 1860”，該株系由位于英國(guó) Pirbright 研究所的兩個(gè)口蹄疫實(shí)驗(yàn)室保藏[9]。

這一方面警示我們需要進(jìn)一步加強(qiáng)相關(guān)領(lǐng)域的管理水平，同時(shí)表明如果真的發(fā)生了人為失誤導(dǎo)致病毒的二次暴發(fā)，科學(xué)家有辦法有效地追蹤其來(lái)源。

“

作者簡(jiǎn)介

作者吳蕾為中國(guó)科學(xué)院大學(xué)研究生。

”

參考文獻(xiàn)

1.Han, Y., et al., Single-cell transcriptome analysis reveals widespread monoallelic gene expression in individual rice mesophyll cells. Science Bulletin, 2017. 62(19): p. 1304-1314.

2.Huan, Q., et al., HeteroMeth: A Database of Cell-to-cell Heterogeneity in DNA Methylation. Genomics Proteomics Bioinformatics, 2018. 16(4): p. 234-243.

3.Pascall, D.J., et al., 'Frozen evolution' of an RNA virus suggests accidental release as a potential cause of arbovirus re-emergence. PLoS Biol, 2020. 18(4): p. e3000673.

4.Sailleau, C., et al., Re-Emergence of Bluetongue Virus Serotype 8 in France, 2015. Transbound Emerg Dis, 2017. 64(3): p. 998-1000.

5.Thomas, F., E. Singh, and W. Hare, Control of bluetongue virus spread by embryo transfer. Progress in clinical and biological research, 1985. 178: p. 653.

6.Backx, A., et al., Clinical signs of bluetongue virus serotype 8 infection in sheep and goats. The Veterinary Record, 2007. 161(17): p. 591.

7.Haegeman, A., et al., Failure to remove bluetongue serotype 8 virus (BTV-8) from in vitro produced and in vivo derived bovine embryos and subsequent transmission of BTV-8 to recipient cows after embryo transfer. Frontiers in Veterinary Science, 2019. 6: p. 432.

8.Rozo, M. and G.K. Gronvall, The Reemergent 1977 H1N1 Strain and the Gain-of-Function Debate. mBio, 2015. 6(4).

9.Cottam, E.M., et al., Transmission pathways of foot-and-mouth disease virus in the United Kingdom in 2007. PLoS Pathog, 2008. 4(4): p. e1000050.

制版編輯 | 皮皮魚(yú)

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BTV-8被 “凍結(jié)” 的進(jìn)化