京港感染論壇
早診快診，助力精準(zhǔn)防治
論文摘要
傳染病是對(duì)人類健康最大的威脅之一，造成巨大的傷殘和死亡負(fù)擔(dān)。對(duì)傳染病快速診斷和治療可以更好地理解其致病機(jī)制。世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)為理想的檢測(cè)外來病原體方法應(yīng)是快速、特異、靈敏、無需復(fù)雜儀器、且具有成本效益。目前的病原體核酸檢測(cè)方法(典型的是PCR方法)具有許多局限性，例如需要復(fù)雜的儀器和試劑、專門的PCR實(shí)驗(yàn)室、經(jīng)過訓(xùn)練的技術(shù)人員，而且檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)。因此迫切需要研發(fā)快速、靈敏、特異、成本低的新型核酸檢測(cè)方法，尤其是可用于不同場(chǎng)景的床旁診斷裝置。SHERLOCK和DETECTR兩種新方法基于CRISPR-Cas效應(yīng)分子的體外特性，將活化的核酸酶與特異性核酸結(jié)合，然后這些效應(yīng)分子與各種報(bào)告基團(tuán)結(jié)合，并同時(shí)聯(lián)合等溫?cái)U(kuò)增方法，建立了在多種模式下的高靈敏度檢測(cè)方法。盡管仍處于起始階段，SHERLOCK和DETECTR有望快速檢測(cè)病原體，具有超高靈敏度，且不需要復(fù)雜的檢測(cè)過程。本綜述介紹了SHERLOCK和DETECTR技術(shù)，并評(píng)估了它們的性能、功能、以及作為診斷傳染病和遏制疾病暴發(fā)最佳診斷工具的前景。
一、通過CRISPR-Cas系統(tǒng)檢測(cè)核酸
CRISPR-Cas系統(tǒng)在2016年第一次應(yīng)用于分子診斷，它的特征和應(yīng)用見表1。Kellner團(tuán)隊(duì)研發(fā)的基于CRISPR診斷技術(shù)結(jié)合了核酸預(yù)擴(kuò)增和CRISPR-Cas酶學(xué)特點(diǎn)，來特異性識(shí)別靶DNA或RNA，稱為“Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking”，即SHERLOCK技術(shù)。它可以多重靶標(biāo)、便攜、高靈敏地檢測(cè)臨床樣本中DNA和RNA序列。2018年張峰團(tuán)隊(duì)建立了基于VI型CRISPR-Cas系統(tǒng)的SHERLOCK，它依賴于Cas13核酸酶，特異性識(shí)別和切割RNA。如果樣本中有靶核酸片段，Cas13能通過CRISPR相關(guān)RNA(crRNA)識(shí)別它們并切開熒光探針的序列，使熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)失去相互作用，釋放出可檢測(cè)的熒光信號(hào)，但它只能定性而不能定量檢測(cè)。
第二代SHERLOCKv2通過加入Cas13a和Csm6可以提高信號(hào)強(qiáng)度，從而使靈敏度增加3.5倍。此外第二代SHERLOCKv2可檢測(cè)多重靶標(biāo)，每種報(bào)告探針設(shè)計(jì)為獨(dú)特的序列并標(biāo)記不同熒光素，然后設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的向?qū)NA序列。SHERLOCKv2通過商品化的側(cè)流試條，可肉眼觀察顏色變化來判讀結(jié)果，且不需要特殊儀器。它僅需把樣本加入試條一步操作，不需要分離純化核酸?？傊?，SHERLOCKv2具有超高的敏感性，可實(shí)現(xiàn)多重靶標(biāo)檢測(cè)，并通過側(cè)流試條顯色來肉眼判讀結(jié)果。
2017年Jennifer Doudna團(tuán)隊(duì)研發(fā)的“DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter”，即DETECTR技術(shù)。它依賴Cas12a識(shí)別靶RNA后活化的Cas12a蛋白活性，可降解附近DNA序列。Cas12a和靶標(biāo)crRNA與單鏈DNA報(bào)告探針互補(bǔ)結(jié)合并加入臨床樣本中，crRNA識(shí)別病原體核酸序列，然后破壞DNA報(bào)告探針釋放熒光信號(hào)。DETECTR起始階段加入恒溫預(yù)擴(kuò)增的重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification, RPA)來富集靶序列，可增加檢測(cè)靈敏度且不依賴復(fù)雜和昂貴的儀器。不同Cas酶(Cas9、Cas12a和Cas13a)的功能和特征見表2。
圖1. SHERLOCKv2、SHERLOCK、DETECTR三種檢測(cè)系統(tǒng)的模式圖。無靶核酸時(shí)Cas核酸酶為無活性狀態(tài)。當(dāng)向?qū)rRNA與相應(yīng)序列(Cas13a為RNA，Cas12a為ssDNA或dsDNA)結(jié)合時(shí)，核酸酶被激活可切割相應(yīng)序列，此時(shí)通過一段寡核苷酸(黑色)與淬滅基團(tuán)連接的熒光報(bào)告基團(tuán)(綠色)可發(fā)出不斷增強(qiáng)的熒光信號(hào)。臨床樣本在核酸提取后，通過恒溫預(yù)擴(kuò)增的重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification, RPA)或逆轉(zhuǎn)錄RPA來擴(kuò)增靶DNA或RNA。RPA產(chǎn)物在含有T7 RNA聚合酶、Cas13、靶標(biāo)特異性crRNA和RNA熒光報(bào)告基團(tuán)的反應(yīng)體系中被檢測(cè)出來。
表1. 基于CRISPR-Cas診斷工具的特征和應(yīng)用
表2. Cas9、Cas13a、Cas12a酶的功能和結(jié)構(gòu)特征
二、基于CRISPR診斷方法與PCR方法的比較
PCR的優(yōu)點(diǎn)是病原學(xué)分子診斷中最經(jīng)典和有效的方法，能檢測(cè)出低至一個(gè)拷貝的病原體基因組。局限性是需要復(fù)雜的熱循環(huán)儀器，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程，需要處理試劑，需要完善的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和合格檢測(cè)的人員，耗時(shí)長(zhǎng)且無法用于大范圍人群篩查。
CRISPR的優(yōu)點(diǎn)是超敏、特異、無需復(fù)雜儀器和操作、通過等溫?cái)U(kuò)增和Cas-sg/crRNA復(fù)合物對(duì)目的序列的特異性識(shí)別來提高準(zhǔn)確度。局限性為僅能檢測(cè)已知序列。
建議進(jìn)行大規(guī)模的關(guān)于各種基于PCR和基于CRISPR-Cas診斷方法的比較研究。
三、基于CRISPR的診斷系統(tǒng)用于檢測(cè)新發(fā)傳染病
在新型冠狀病毒檢測(cè)中，DETECTR檢測(cè)SARS-CoV-2特異性N基因和E基因，如果兩個(gè)基因同時(shí)陽(yáng)性則可報(bào)陽(yáng)性結(jié)果，并且該方法經(jīng)過改進(jìn)可排除其它冠狀病毒引起的假陽(yáng)性結(jié)果，且能在1h內(nèi)出結(jié)果。而SHERLOCK主要檢測(cè)SARS-CoV-2的S基因和Orflab基因。
四、CRISPR診斷技術(shù)的潛在應(yīng)用
DETECTR最顯著的特征是它準(zhǔn)確性高、耗時(shí)非常短(見圖2)，它可用于在人乳頭瘤病毒(HPV)感染的細(xì)胞系或臨床樣本中檢測(cè)HPV及分型。SHERLOCK能通過細(xì)菌16S rRNA基因V3可變區(qū)的RPA通用引物來鑒定細(xì)菌，也可用于細(xì)菌和病毒的鑒定和分型，以及耐藥基因檢測(cè)。SHERLOCK具有分辨單個(gè)堿基突變的能力，所以可用來篩查單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
圖2 DETECTR、SHERLOCK和CDC/WHO推薦方法(PCR法)檢測(cè)新冠病毒所需時(shí)間比較
五、不同CRISPR檢測(cè)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)和局限性
SHERLOCK具有超高的靈敏度和特異度，能在1μl樣本中檢測(cè)出單分子的DNA或RNA靶標(biāo)，在按比例增加預(yù)擴(kuò)增體積后，可在更大量的樣本(高達(dá)540μl)中實(shí)現(xiàn)單分子靶標(biāo)檢測(cè)。有賴于Cas13和Cas12酶的特異性，SHERLOCK試劑凍干或長(zhǎng)期保存而不會(huì)影響靈敏度和特異度。SHERLOCK耗時(shí)非常短，PRA作為初始反應(yīng)僅需5-10分鐘，然后轉(zhuǎn)移到Cas13檢測(cè)系統(tǒng)，這步只需5分鐘。SHERLOCK的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是它相比于其它檢測(cè)系統(tǒng)(例如TaqMan-qPCR)價(jià)格非常便宜。
然而SHERLOCK在某些情況下也有局限性，例如它目前有些反應(yīng)試劑組分的制備在蛋白純化和RNA生物學(xué)方面較為復(fù)雜，預(yù)先設(shè)計(jì)的試驗(yàn)包括反應(yīng)混合物和DNA/RNA多聚核苷酸目前仍沒有商品化。因此如果不是對(duì)檢測(cè)速度和便攜性有很高要求，例如腫瘤學(xué)檢測(cè)中，現(xiàn)有的檢測(cè)方法(比如PCR)可能更適用于這些場(chǎng)景。SHERLOCK的另一個(gè)潛在局限性是它的多步驟核酸擴(kuò)增過程，可能影響對(duì)靶標(biāo)的精確定量。盡管可用于定量，但是它不能像微滴式數(shù)字PCR那樣做到絕對(duì)定量。它不能檢測(cè)出靶標(biāo)含量的細(xì)微差別(<2×變化)。因此SHERLOCK在精確基因表達(dá)譜檢測(cè)中應(yīng)用較少。
DETECTR最重要的特點(diǎn)是速度快，其它優(yōu)勢(shì)包括不需要復(fù)雜儀器(便攜性)，很少出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。它可在70-300copies/μl范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)單分子檢測(cè)，并可用于區(qū)分病毒亞型。
一般來說，CRISPR-Cas方法僅能用于檢測(cè)已知DNA序列，這在某些情況下應(yīng)用受到了限制。
六、總結(jié)
SHERLOCK和DETECTR開啟了分子診斷的新時(shí)代。它們具有便攜、敏感性高的優(yōu)勢(shì)，適用于診斷新發(fā)傳染病和非傳染病，且耗時(shí)僅在1小時(shí)內(nèi)。但它也同樣面對(duì)著一些挑戰(zhàn)。
盡管剛剛起步，SHERLOCK和DETECTR有望改變我們對(duì)病原體的診斷能力。它具有超高敏感度且不需要復(fù)雜操作，因此適用于人群篩查從而可更好地控制傳染暴發(fā)。因?yàn)槠涑杀镜?，所以適用范圍很廣，尤其是資源短缺的國(guó)家。因此我們相信CRISPR-Cas系統(tǒng)正在引領(lǐng)一場(chǎng)生物技術(shù)革命。
參考文獻(xiàn)（上下滑動(dòng)）
Mustafa MI, Makhawi AM. SHERLOCK and DETECTR: CRISPR-Cas Systems as Potential Rapid Diagnostic Tools for Emerging Infectious Diseases. J Clin Microbiol, 2021, 59(3): e00745-20.
END
作者｜魏大力、黃磊 北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科
單位｜北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科
審校｜馬立艷 北京友誼醫(yī)院檢驗(yàn)科
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