自從1796年，EdwardJenner發(fā)現了第一個疫苗后，疫苗已經成為世界上最重要的公共健康干預方法之一，疫苗的使用有效的降低感染性疾病的風險，每年阻止了數百萬人的死亡。大多數得到許可的疫苗都是通過促進B細胞來產生抗體保護機體免受感染性疾病的侵害，但是獲得一個擁有較好的免疫效應的天然抗體是很難的。
近幾年出現的高通量測序技術可以對抗體庫進行高質量的特性分析，同時也可以分析疫苗免疫前后機體的抗體庫的變化。這種利用高通量測序分析抗體庫的方法也提高了利用特異性抗體序列來評估疫苗免疫效應的概率。
B淋巴細胞在特定抗原的刺激下，能夠分化、增殖形成具有針對這種抗原分泌特異性抗體的能力。人體里分布的擁有不同的重鏈重排的B細胞的數量大概至少為106個，盡管理論推斷每個成年人至少應該有1011個B細胞來產生抗體。
最初機體的抗體多樣性是由在B細胞的成熟過程中多個V（可變區(qū)片段）基因和D（高變區(qū)）基因以及連接基因（J）片段的體細胞重組形成有功能的VL以及VH，并且通過在連接處減少或者增加P和N核苷酸來增加抗體多樣性。隨后在一個新抗原入侵時，機體會對抗原發(fā)生反應，在這期間通過幾輪的的體細胞高突變進一步增加了VH/VL的多樣性，最終選擇在胚系基因中心提高抗原結合能力的B細胞。不同抗體又擁有不同的抗原表位，這種抗體抗原表位的多樣性是識別潛在的病原的重要因素。
所有的體內循環(huán)的抗體的總數被稱為抗體庫。每個個體的抗體庫可能由很多不同的因素決定，包括他們的基因型和染色體結構、個人年齡差別以及抗原接觸歷史等。對抗體庫的研究將會為臨床疾病診斷、愈后追蹤和治療方法的選擇提供便利的條件。但是抗體庫多樣性的數量是驚人的，如果考慮到工作量和花費問題，利用傳統(tǒng)的測序方法去分析這樣大量的抗體庫多樣性是不切實際的。
近幾年出現的NGS測序技術，又稱二代測序技術，能一次并行對幾百萬條DNA分子進行序列分析，通過NGS測序平臺得到的大量測序數據非常適合用于像抗體庫這樣多樣化基因片段的復雜集合的全面分析。對抗體庫的高通量測序分析更能準確的反映抗體基因頻率以及體細胞突變模型。
當設計一個對抗體庫高通量測序的實驗時，我們第一個問題便是測什么？盡管很多問題需要對整個抗體可變區(qū)進行測序，但是高通量測序的平臺對測序的長度是有要求的，完整的抗體序列無法測序，如果將序列打斷成小片段測序后在拼接就會出現很多人為誤差?？紤]到最初鑒定抗體時，僅僅只是通過確定CDR3區(qū)來鑒定可變區(qū)基因序列的，這就表明同樣的CDR3序列經常在擁有不同CDR1和CDR2的多個可變區(qū)基因中使用。這很可能是體細胞基因轉化造成的，在V(D)J重排后，第二次的基因重排主要發(fā)生在V基因片段的上游和已經重排的V(D)J基因中。所以高通量測序可以只對可變區(qū)的CDR3區(qū)進行測序，CDR3序列可以被當作淋巴細胞來源的抗體的的編號，以其讀長更短以及更高的通量可以被有效的測序。
除此之外，如何從高通量測序得到的龐大數據中得到我們需要的抗體序列呢？首先，是基于數量策略：如果一個抗體序列在抗體庫中出現頻率特別高，就有可能具有特殊功能。Reddy等人就是從免疫后的小鼠骨髓淋巴細胞中挑選了頻率最高的抗體序列表達得到抗原特異性抗體。其次，是基于序列標簽策略：當在序列的一致性比較高的情況下，已知抗體序列的獨特性也可以被用來調取擁有相似的抗原識別位點的抗體。最后是基于系統(tǒng)進化的策略：系統(tǒng)進化歷程相似的序列經常表明蛋白之間有功能相關性。Wu等人就是通過利用系統(tǒng)進化歷程的關系比較已有的一類VRC01抗體序列，發(fā)現這些序列在系統(tǒng)發(fā)育上都是相近的。同樣的，zhu等人利用系統(tǒng)進化分析的方法，從一個未知VRC01類型的新患者體內發(fā)現了一種新的VRC01類型并制備得到高親和力的抗體。
利用高通量測序技術對抗體庫進行分析，可以使我們對免疫系統(tǒng)有更新的認識，并且在臨床診斷、抗體藥物的發(fā)現以及疫苗的制備方面都有很大的意義。
雜交瘤技術是最初制備單克隆抗體的方法，而隨后出現的體外展示技術是目前制備人源化單抗的主要方法，它主要通過核糖體、噬菌體等展示文庫篩選得到大量的能夠識別特定的抗原表位或構型的抗體。展示文庫篩選抗體包括連續(xù)幾輪淘洗，這種篩選過程可以逐漸從多樣性的抗體庫中篩選出較少的所需要的高親和力和特異性高的的抗體克隆。然而，在展示文庫篩選的過程中，由于一些表達高質量的抗體克隆會對編碼它們的細胞的生長產生不利的影響，因此它們競爭不過那些快速生長但表達低質量抗體的克隆，所以在淘洗的過程中，有一些我們希望留住的抗原結合能力強的編碼抗體的克隆會被篩選出去，但是高通量測序技術與噬菌體展示技術聯合使用，對抗原篩選了一輪或者兩輪的展示文庫進行序列分析，通過高頻出現的序列配對合成產生抗體，這種方法就可以得到那些在展示文庫的篩選過程中未被發(fā)現的但能夠編碼高親和力的抗體。Saggy等利用蛋白免疫小鼠后分離得到B淋巴細胞，利用高通量測序和噬菌體展示文庫兩種技術分別制備抗體，將兩種技術分別制備的抗體作對比，發(fā)現高通量測序制備的抗體對抗原的特異性更高，除此之外，噬菌體展示技術制備的抗體的多樣性較低，一些高通量測序得到的可溶性抗原特異性的抗體在噬菌體展示技術中并未出現，因此，這兩種方法可以相互輔助來制備不同的抗原特異性抗體。除此之外，Zhu等利用高通量測序技術對HIV患者血清中的廣譜中和性抗體的VH和VL進行深度測序，對得到的數據進行系統(tǒng)進化樹分析，發(fā)現在系統(tǒng)進化樹的相對應的分支上配對后的VH和VL能夠產生高親和力的特異性抗體。這種利用高通量測序技術構建系統(tǒng)進化樹分析制備抗體的方法尤其適用于高水平體細胞突變的疾病的抗體的鑒定和制備。
NGS測序技術也可以應用到血清中抗體的蛋白組學分析。
B細胞的主要效應功能是分泌抗體到血液或者粘膜和呼吸道上皮細胞中，但是在這些體液里的抗體庫的組成成分仍然是讓人難以捉摸。Cheung、Fridy等結合高通量測序技術與高效液相色譜—串聯質譜檢測技術，對免疫后動物的血清中抗原特異性抗體進行分離，消化為肽片段進行液相-質譜分析，與此同時，對免疫后動物的B細胞所編碼的可變區(qū)基因進行高通量測序，通過兩種技術的比對，最終得到了目的VH和VL并進行配對重組表達。利用這種方法，從免疫的小鼠、兔子以及駱駝血清中快速篩選得到了針對不同抗原的高親和力的抗原特異性抗體。利用NGS測序技術發(fā)現和鑒定在血清中的效應B細胞的VH和VL配對產生的抗原特異性抗體的方法，能夠快速的獲得新的診斷、治療或者預防性抗體。為我們從康復期病人體內分離獲得生物學相關的治療性的抗體提供了新的思路。
抗體庫的高通量測序技術也可以用于由病原體刺激或者接種疫苗而產生的獲得性免疫效應的機理研究。通過對患有慢性丙型肝炎的患者的免疫球蛋白高通量測序發(fā)現，與健康人相比較，患者的抗體庫的V、D、J基因片段的排列以及使用長度發(fā)生了很大的改變，抗體庫的多樣性也降低。Parameswaran和他的工作團隊發(fā)現感染急性登革熱患者體內有保守的抗體標簽（相同模式的CDR-H3序列），同樣的，Krause等通過對抗體庫的高通量測序也發(fā)現在感染了流感的不同患者體內的抗體擁有相同的保守抗原結合位點。這就提示我們可以利用高通量測序技術在感染了同種疾病的人群中找到疾病特異性的CDR3，經過驗證后的這些CDR3序列就可以作為代表該病的并可以從外周血中查到的抗體標簽。也就是說，可以利用NGS測序技術作為檢測感染疾病的一種診斷工具。
高通量測序技術除了有診斷的作用外，還可以利用高通量測序技術分析不同年齡段的人群注射疫苗后的效果來促進針對不同人群的疫苗研發(fā)。研究發(fā)現與青年群體相比較，傳染性疾病對老年人的感染率以及致死率都要高，尤其是像肺炎球菌肺炎這類肺部疾病，即使老人注射疫苗也不能得到有效的保護。與青年群體相比較，老年個體在接種流感疫苗后，IgM和IgA的CDR-H3的多樣性也有降低，說明老年人體內的B細胞庫數量減少，這就導致老年人的體液免疫受損。同樣的，Jiang等通過分析來自不同年齡段的志愿者在接種流感疫苗前后的重鏈可變區(qū)庫的抗體胚系基因結構、同種型和突變的程度發(fā)現與青年群體相比較，老年個體在接種疫苗后抗體庫的多樣性有部分的降低。所以可以通過二代測序技術對疫苗免疫前后的個體抗體庫在基因水平上進行動態(tài)監(jiān)測，從而評估疫苗的效果，除此之外，其還能為某些仍缺乏良好免疫效果疫苗的疾病開發(fā)新型疫苗提供新思路。
自身免疫性疾病和原發(fā)性免疫缺陷癥的發(fā)病機理目前還未研究清楚，目前利用高通量測序技術對免疫失調的病人的抗體庫的分析的研究還很少。H.-Christian和他的團隊通過對多發(fā)性硬化癥患者腦脊液中的B細胞和外周血中的B細胞高通量測序發(fā)現在外周血以及中樞神經系統(tǒng)含有相同的效應B細胞，通過檢測外周血中的B細胞增殖就可以判斷在多發(fā)性硬化癥或者其他炎癥的中樞神經系統(tǒng)中B細胞的增殖情況，這一指標可以用于研究疾病發(fā)展情況和治療效果分析。突發(fā)性IgG4相關的膽管炎，是一種與血清中IgG4的含量相關的自身免疫疾病，高通量測序發(fā)現在患者受影響的組織和外周血中有大量的IgG4克隆增殖發(fā)生，但是在皮質類固醇的治療后，這種IgG4克隆增殖就消失了，這就表明IgG4克隆增值量的測定是辨別疾病的一個顯著特征。因此，自身免疫性疾病的研究可以通過高通量測序識別潛在自體反應克隆來定量早期或已確診的自身免疫性疾病患者的外周血抗體庫，作為早期診斷用藥的依據。
在B細胞成熟的各個階段會產生一系列疾病，比如說白血病，淋巴瘤和骨髓瘤等惡性腫瘤。我們可以通過高通量測序比較患者用藥前后抗體組庫的變化來監(jiān)測疾病指導用藥，預防腫瘤復發(fā)，也可以通過檢測腫瘤模板克隆型，作為癌癥早期診斷、預防手段。利用NGS測序技術對治療后的慢性淋巴細胞型白血病病人的外周血里的可變區(qū)基因測序，可用于動態(tài)監(jiān)測治療后患者體內癌癥細胞以及微小殘留白血病，也可用于治療后效果的評估以及疾病復發(fā)的監(jiān)測。目前臨床檢測慢性淋巴細胞型白血病和其他的一些淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤的治療效果時，大多采用的方法是對每一位患者進行特異性PCR來驗證疾病是否復發(fā)，但過程繁瑣。利用高通量測序技術，只需要分析治療前后患者的抗體庫的變化，進而檢測由白血病患者編碼的抗體是否存在就可以判斷疾病是否復發(fā)。除此之外，對慢性淋巴細胞白血病和惡性血液病患者分析發(fā)現在很多患者中都能檢測到相同的CDR-H3模板。這種惡性腫瘤模板克隆型在還未真正顯示臨床疾病的受試者中出現的頻率很低，因此，利用高通量測序技術檢測患者體內惡性腫瘤模板克隆型可以作為一種有效的早期診斷工具。
