做單抗大家都比較“歧視”IgM亞型，上文我們也討論了如何盡量避開IgM亞型，如果我們躲之不及怎么辦呢？
其實(shí)，IgM類單抗也沒有你們想的那么糟糕，純化也沒有你們想象的那么困難；小福就來給大家簡(jiǎn)單說說。
IgM屬于優(yōu)球蛋白，什么是優(yōu)球蛋白呢？百度百科是這么講的：低離子強(qiáng)度下或在蒸餾水中不溶解的血漿球蛋白稱為優(yōu)球蛋白；一般情況下，血清蛋白質(zhì)在蒸餾水或低鹽離子白蛋白為可溶，球蛋白一般不溶，而偏偏那部分“不聽話的”，能溶解的球蛋白我們稱其為偽球蛋白，大部分不溶解的那部分稱其為優(yōu)球蛋白。
我們從以上的描述中可以知道，IgM有不溶于水或者低離子溶液的特性，所以，對(duì)付IgM純化第一招：去離子水透析法。把腹水裝到透析袋里面放在去離子水里面透析。當(dāng)然，透析之前，需要把腹水里面的降植烷/液體石蠟等這些油脂類去除，去除的辦法是二氧化硅粉末，同時(shí)要去除不溶物。我們透析完成之后，IgM在沉淀里面，需要用PBS等溶液復(fù)溶，并結(jié)合其他的手段進(jìn)一步處理；在蛋白純化領(lǐng)域，一步法親和層析不是萬能鑰匙。
IgM純化第二招：抗IgM特異性親和層析法。
此法成本偏高，需要購(gòu)買高品質(zhì)的抗IgM亞型的抗體幾毫克，將這些抗體通過共價(jià)偶聯(lián)結(jié)合到活性瓊脂糖凝膠上，制備成親和柱;親和柱制備好以后，其純化IgM的方法，與Protein A，Protein G純化抗體方法相同，此處不贅述；至于抗體共價(jià)偶聯(lián)到活性瓊脂糖凝膠上的步驟與方法，在福因德官網(wǎng)都可以找到，如果還有疑問，可以與我們技術(shù)支持聯(lián)系。
做蛋白和抗體純化比較少的實(shí)驗(yàn)者，往往只了解親和層析純化法，因?yàn)閷懛椒ê?jiǎn)單，對(duì)于大部分的蛋白和抗體來說，純化步驟比較穩(wěn)定，純化工藝不需要詳細(xì)摸索（其實(shí)，這是一個(gè)誤區(qū)，如果項(xiàng)目一個(gè)抗體或者蛋白純化好，純化方案摸索和優(yōu)化少不了）。
IgM純化第三招：羥基磷灰石（HAP）層析法
羥基磷灰石是什么東西？ 它的英文：Hydroxyapatite；分子式Ca10(PO4)6(OH)2，是磷酸鈣的晶體；晶體表面有大量帶正電荷的Ca2+離子和帶負(fù)電的PO43-離子，還有OH集團(tuán)；這些離子一般不與小分子結(jié)合，只與生物大分子結(jié)合，并且結(jié)合力最強(qiáng)，磷酸鹽濃度梯度洗脫，可以把不同的抗體組分分別洗脫；對(duì)于抗體純化而言，用pH6.8的磷酸鈉緩沖液濃度從10mM到350mM,最后洗脫峰是IgM，純度可達(dá)93%以上。
羥基磷灰石（HAP）層析法具體實(shí)施步驟，我們?cè)谥蠓窒?/p>
IgM純化其他招：粗沉淀加上分子篩（顆粒排阻法）
沉淀法有硫酸銨沉淀和PEG沉淀，等等。
硫酸銨沉淀沒什么好說的，50%飽和硫酸銨沉淀。但是這個(gè)飽和硫酸銨的配制和滴加還是很有技巧的，保持4℃。
PEG沉淀法這個(gè)大家只聽說，很少使用；我們簡(jiǎn)單介紹下，分子量選擇5000-7000的，配成30%的溶液，逐滴加入經(jīng)過粗處理的腹水溶液(等體積PBS與腹水混合)中至終濃度4%，滴加過程在磁力攪拌器上進(jìn)行。
最后再說分子篩（顆粒排阻法）
分子篩原理是：凝膠顆粒直徑大小不同，顆粒內(nèi)部有很多孔徑，分子量小于顆粒孔徑的就會(huì)“鉆”入顆粒內(nèi)部，多走一程，分子量較大的，”鉆不進(jìn)去“，會(huì)從顆粒之間的間隙通過，由于走的路程不一樣，所以每個(gè)分子從柱子底部流出來的時(shí)間也不一樣，接收不同的峰值，不同的蛋白分子處于相應(yīng)峰值內(nèi)。
以上的方法，似乎都很折騰，一步到位似乎不行，這個(gè)時(shí)候你不妨試試基因工程抗體，將細(xì)胞株的抗體基因都調(diào)取出來，構(gòu)建抗體表達(dá)載體，利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)無血清表達(dá)抗體，抗體非常容易純化，最高每升可以達(dá)到幾百號(hào)毫克到克級(jí)。
在不斷解決合作伙伴的技術(shù)難題的時(shí)候，針對(duì)魚類IgM的純化，我們研發(fā)出了好用的試劑：魚IgM純化試劑盒（Cat No.:IGP0021K）,小伙伴們不妨試試。
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