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▋  廖昊1,2， 王杰2， 魯鳳民2

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1 北京大學(xué)深圳醫(yī)院， 深圳北京大學(xué)香港科技大學(xué)醫(yī)學(xué)中心

2 北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系暨感染病中心

1  血清HBV RNA的存在形式和來(lái)源

1996年，德國(guó)學(xué)者K?ck等在HBV感染者血清中首次發(fā)現(xiàn)HBV RNA的存在，后續(xù)相繼開展了臨床意義探索研究。

2016年，筆者團(tuán)隊(duì)和其他課題組先后系統(tǒng)地證實(shí)血清中的HBV RNA為未經(jīng)或部分逆轉(zhuǎn)錄的、存在于核衣殼內(nèi)的前基因組RNA（pgRNA），來(lái)自于感染肝細(xì)胞內(nèi)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）的轉(zhuǎn)錄。隨后，其他研究團(tuán)隊(duì)也得出相似的研究結(jié)果。雖然關(guān)于血清中的HBV RNA是否主要存在于帶有病毒包膜的病毒樣顆粒內(nèi)仍存不同觀點(diǎn)，但均一致認(rèn)為血清HBV RNA主要存在于病毒核衣殼內(nèi)，這一特性使其能相對(duì)穩(wěn)定地存在于血液中。

慢性乙型肝炎（CHB）患者接受核苷（酸）類藥物（NAs）治療后，可有效阻斷HBV松弛環(huán)狀DNA（rcDNA）的合成，在短期內(nèi)可導(dǎo)致循環(huán)血中未經(jīng)或部分逆轉(zhuǎn)錄的pgRNA水平增加；但在長(zhǎng)期的NAs治療下，伴隨著肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA減少，細(xì)胞內(nèi)外的HBV RNA水平隨之下降。HBV pgRNA存在不同長(zhǎng)度的剪切變異體，但其存在的意義尚未完全闡明。NAs治療除了可使異常的剪接變異體增加外，也可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外出現(xiàn)大量pgRNA 3′末端截短體，致使血清中的HBV RNA病毒樣顆粒復(fù)制缺陷，使其缺乏感染能力。

2  影響血清HBV RNA水平的因素

一般而言，CHB患者血清中的HBV RNA低于HBV DNA水平。Butler等研究發(fā)現(xiàn)，HBsAg陽(yáng)性的獻(xiàn)血者中血清HBV RNA水平約為HBV DNA水平的1/100。多項(xiàng)研究證實(shí)，處于不同自然史階段的慢性HBV感染者其血清HBV RNA的水平存在明顯差異。

Wang等將102例慢性HBV感染者根據(jù)臨床自然史分為4期：免疫耐受期HBV RNA水平最高，均值為6.78 log10 拷貝/ml，其次是免疫清除期5.73 log10 拷貝/ml，再活動(dòng)期4.52 log10 拷貝/ml和低病毒復(fù)制期2.96 log10 拷貝/ml。

van Campenhout等檢測(cè)了488例慢性HBV感染者血清HBV RNA水平，這些患者的HBV基因型的分布分別為A基因型21%、B基因型10%、C基因型20%、D基因型46%和其他基因型3%。其中HBeAg陽(yáng)性患者血清HBV RNA平均水平（6.5 log10 拷貝/ml）顯著高于HBeAg陰性患者（4.1 log10 拷貝/ml），相對(duì)于D基因型而言，A、B和C 基因型的HBV RNA水平較低。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)低水平的HBV RNA與HBV基因組存在基本核心啟動(dòng)子突變或者前C區(qū)聯(lián)合突變有關(guān)，并且血清HBV RNA水平與ALT水平呈正相關(guān)。

由此可見，血清HBV RNA的水平在不同疾病進(jìn)展階段的CHB患者中存在差異，在應(yīng)用血清HBV RNA這一指標(biāo)時(shí)應(yīng)考慮以上影響因素，并與其他病毒學(xué)指標(biāo)和生化指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用，以準(zhǔn)確判斷病毒的復(fù)制情況和疾病進(jìn)展。

3  血清HBV RNA與其他的病毒血清學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性

血清HBV RNA作為新的病毒學(xué)指標(biāo)，需要進(jìn)一步了解其與傳統(tǒng)指標(biāo)間的關(guān)系，以利于其在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用。多項(xiàng)研究證實(shí)，血清中的HBV RNA與肝組織中的pgRNA高度相關(guān)，這在一定程度上也進(jìn)一步證明了其來(lái)源于cccDNA的轉(zhuǎn)錄。此外，在不同基因型的HBV中，血清HBV RNA與血清HBV DNA、HBsAg和HBeAg均具有相關(guān)性。

筆者團(tuán)隊(duì)前期對(duì)84例非經(jīng)治的慢性HBV感染者進(jìn)行的研究也發(fā)現(xiàn)，血清HBV RNA水平分別與血清HBV DNA（r=0.574，P＜0.001）和HBsAg（r=0.545，P＜0.001）呈正相關(guān)。進(jìn)一步將上述慢性HBV感染者分為HBeAg陽(yáng)性和HBeAg陰性兩組，在HBeAg陽(yáng)性者中血清HBV RNA仍分別與血清HBV DNA（r=0.532，P＜0.001）和HBsAg（r=0.537，P＜0.001）呈正相關(guān)，但在HBeAg陰性者中，血清HBV RNA僅與血清HBV DNA呈正相關(guān)（r=0.741，P＜0.001），而與血清HBsAg無(wú)相關(guān)性（r=0.151，P=0.503）。由此可見，HBeAg陽(yáng)性CHB患者血清HBV RNA與其他的病毒血清學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性優(yōu)于HBeAg陰性患者。

Butler等發(fā)現(xiàn)，在接受NAs治療的CHB患者中，血清HBV RNA水平與HBV DNA水平的相關(guān)性較低。筆者的研究也發(fā)現(xiàn)CHB患者在接受NAs治療后血清HBV DNA常常低于檢測(cè)下限，而大部分患者血清HBV RNA仍可被檢測(cè)，二者不存在相關(guān)性。并且，對(duì)于長(zhǎng)期接受NAs治療、HBsAg處于較低水平的CHB患者，血清HBV RNA水平與HBsAg定量相關(guān)性也逐漸消失，但血清HBV RNA與核心抗原相關(guān)抗原始終保持著較好的相關(guān)性。

需要強(qiáng)調(diào)的是，在接受PEG-IFN治療的CHB患者中血清HBV RNA與HBV DNA在治療過(guò)程中始終具有良好的相關(guān)性。

4  血清HBV RNA可反映肝組織內(nèi)cccDNA的活性或狀態(tài)

HBV cccDNA的持續(xù)存在是導(dǎo)致HBV感染慢性化、CHB久治不愈和停藥后容易復(fù)發(fā)的主要原因。因此，肝組織內(nèi)cccDNA清除是判定HBV感染徹底治愈的一項(xiàng)重要指標(biāo)。然而，臨床上以cccDNA檢測(cè)為目的的肝穿刺活組織檢查難以普遍開展。因此，在無(wú)法直接精確檢測(cè)肝組織內(nèi)cccDNA及其活性的情況下，探索能夠反映肝組織內(nèi)cccDNA活性的替代血清學(xué)指標(biāo)具有十分重要的意義。

Giersch等利用HBV感染的人肝嵌合小鼠進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，血清HBV RNA水平與肝組織內(nèi)cccDNA的水平呈正相關(guān)（r=0.89，P＜0.0001）。筆者的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在未經(jīng)抗病毒治療的HBeAg陽(yáng)性HBV感染者中血清HBV RNA水平與肝組織內(nèi)cccDNA的水平具有相關(guān)性（r=0.39，P=0.002），但這種定量相關(guān)性在HBeAg陰性HBV感染者中消失（r=0.10，P=0.654）。

與Giersch等使用人源化小鼠模型的研究結(jié)果（r=0.89）相比，筆者的研究在HBeAg陽(yáng)性HBV感染者分析得出的血清HBV RNA和肝內(nèi)cccDNA的相關(guān)性相對(duì)較弱（r=0.39），這種差異可能與病毒變異的積累和宿主遺傳背景的多樣性有關(guān)。

此外，Wang等研究發(fā)現(xiàn)未經(jīng)抗病毒治療的CHB患者血清HBV RNA的水平不僅與肝組織中cccDNA的水平相關(guān)，而且與其轉(zhuǎn)錄活性（HBV RNA/cccDNA）具有顯著的相關(guān)性。然而，筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)，盡管CHB患者經(jīng)NAs治療后血清HBV RNA 水平與肝組織內(nèi)cccDNA的水平在定量關(guān)系上無(wú)相關(guān)性，但血清HBV RNA檢測(cè)陽(yáng)性與否仍可反映肝組織內(nèi)cccDNA的狀態(tài)，如在41例長(zhǎng)期接受NAs治療的CHB患者中，20例血清HBV RNA陽(yáng)性的CHB患者其肝組織內(nèi)cccDNA均陽(yáng)性，9例肝組織內(nèi)cccDNA低于檢測(cè)下限的CHB患者中血清HBV RNA均低于檢測(cè)下限，但在12例肝組織內(nèi)cccDNA陽(yáng)性的CHB患者血清中HBV RNA低于檢測(cè)下限。該研究結(jié)果提示，在排除檢測(cè)靈敏度的情況下，如果血清HBV RNA陽(yáng)性則反映肝組織內(nèi)存在cccDNA，并處于轉(zhuǎn)錄活躍狀態(tài)；如果血清HBV RNA檢測(cè)不到則反映肝組織內(nèi)cccDNA消失，或者盡管其肝組織內(nèi)cccDNA存在，但處于轉(zhuǎn)錄沉默狀態(tài)。由此可見，在經(jīng)NAs治療的CHB患者中，雖然血清HBV RNA水平與肝組織內(nèi)cccDNA的水平無(wú)相關(guān)性，但可反映肝組織內(nèi)cccDNA的狀態(tài)。

此外，筆者的前期研究還發(fā)現(xiàn)，反映HBV DNA聚合酶（p蛋白）逆轉(zhuǎn)錄活性的血清HBV RNA/HBV DNA比值在不同自然史的慢性HBV感染者中存在顯著差異，據(jù)此認(rèn)為，HBV DNA和HBV RNA的總體水平更能準(zhǔn)確反映肝組織內(nèi)cccDNA的水平及其轉(zhuǎn)錄活性。由于NAs不直接影響HBV RNA的生成，并且3.5 kb的pgRNA僅能來(lái)自于cccDNA的轉(zhuǎn)錄，所以血清HBV RNA可作為反映肝組織內(nèi)cccDNA活性或狀態(tài)的替代血清學(xué)指標(biāo)。

5  血清HBV RNA可用于評(píng)價(jià)抗病毒藥物的療效

已有多項(xiàng)研究證實(shí)血清HBV RNA可用于評(píng)價(jià)NAs抗病毒治療的療效。Huang等通過(guò)分析52例接受拉米夫定或恩替卡韋治療的CHB患者在治療前、治療12周和24周時(shí)的血清HBV RNA水平，發(fā)現(xiàn)在治療12周時(shí)血清HBV RNA水平越低，CHB患者越容易在24周時(shí)實(shí)現(xiàn)HBV DNA陰轉(zhuǎn)，表明血清HBV RNA水平可預(yù)測(cè)CHB患者經(jīng)NAs治療的病毒學(xué)應(yīng)答。

van B?mmel等通過(guò)分析50例接受NAs治療的HBeAg陽(yáng)性CHB患者，發(fā)現(xiàn)HBeAg陰轉(zhuǎn)的患者中血清HBV RNA水平從基線至治療3、6個(gè)月的下降幅度分別顯著高于未發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的患者。同時(shí)，與血清HBV DNA、HBsAg、ALT、HBV基因型、年齡和性別相比，血清HBV RNA水平的下降幅度是預(yù)測(cè)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的最佳血清學(xué)標(biāo)志物。

同樣，Luo等研究發(fā)現(xiàn)獲得病毒學(xué)應(yīng)答的CHB患者在恩替卡韋治療期間血清HBV RNA水平的下降幅度顯著高于未獲得病毒學(xué)應(yīng)答的患者，并且血清HBV RNA水平在治療基線 ＜ 4.12 log10 拷貝/ml的CHB患者更容易發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。此外，監(jiān)測(cè)血清HBV RNA水平還可預(yù)測(cè)經(jīng)拉米夫定治療的CHB患者出現(xiàn)病毒耐藥突變的風(fēng)險(xiǎn)。

此外，Wang等研究發(fā)現(xiàn)血清HBV RNA水平與肝臟炎癥程度評(píng)分（r=0.665，P＜0.001）及纖維化程度評(píng)分（r=0.722，P＜0.001）均具有相關(guān)性，提示檢測(cè)血清HBV RNA水平可預(yù)測(cè)CHB患者經(jīng)NAs治療后的肝組織學(xué)改善。

監(jiān)測(cè)血清HBV RNA水平還可預(yù)測(cè)CHB患者PEG-IFN治療的療效。Jansen等研究發(fā)現(xiàn)NAs聯(lián)合PEG-IFN治療的CHB患者，其血清HBV RNA水平的下降幅度顯著高于NAs單藥治療的患者，并且在HBeAg陰性CHB患者中基線時(shí)較低的血清HBV RNA水平與病毒學(xué)應(yīng)答獨(dú)立相關(guān)。同樣，van B?mmel等研究也發(fā)現(xiàn)CHB患者在接受PEG-IFN治療過(guò)程中，其血清HBV RNA水平的動(dòng)態(tài)變化可預(yù)測(cè)病毒學(xué)應(yīng)答的發(fā)生情況，對(duì)于預(yù)期應(yīng)答不佳的患者應(yīng)盡早更換抗病毒方案，使患者獲得最佳的治療效果。

目前多家企業(yè)及科研單位正在開發(fā)針對(duì)HBV生命周期不同階段的新型抗病毒藥物，包括病毒與細(xì)胞受體結(jié)合抑制劑、新的病毒聚合酶抑制劑、衣殼裝配抑制劑、病毒釋放阻滯劑，以及cccDNA形成和轉(zhuǎn)錄抑制劑等。除了這些直接抗病毒藥物外，還在研發(fā)包括Toll樣受體激動(dòng)劑、檢查點(diǎn)抑制劑和治療性疫苗在內(nèi)的增強(qiáng)抗HBV特異性免疫反應(yīng)的藥物。血清HBV RNA在目前的新藥研發(fā)過(guò)程中已經(jīng)成為評(píng)價(jià)藥物抗病毒療效的一個(gè)重要血清學(xué)指標(biāo)，并已寫入美國(guó)食品藥品管理局關(guān)于抗HBV新藥申報(bào)的指導(dǎo)意見中。

6  血清HBV RNA可預(yù)測(cè)NAs治療停藥后發(fā)生病毒學(xué)反彈的風(fēng)險(xiǎn)

NAs主要通過(guò)抑制HBV DNA的合成發(fā)揮抗病毒作用，患者的血清HBV DNA在用藥后可很快低于檢測(cè)下限。但此類藥物對(duì)cccDNA并無(wú)直接作用，停藥后易出現(xiàn)病毒學(xué)反彈甚至疾病復(fù)發(fā)。因此，各國(guó)（地區(qū)）的CHB管理指南中均強(qiáng)調(diào)接受NAs治療的CHB患者需要進(jìn)行長(zhǎng)期治療，同時(shí)也對(duì)鞏固治療后的停藥提出了建議。

Tsuge等通過(guò)小樣本的回顧性臨床研究發(fā)現(xiàn)停藥點(diǎn)血清HBV RNA 未檢出的患者發(fā)生病毒學(xué)反彈的風(fēng)險(xiǎn)明顯下降。筆者在前期研究中也發(fā)現(xiàn)，21例停藥點(diǎn)HBV RNA陽(yáng)性的CHB患者在停藥后24周全部出現(xiàn)病毒反彈（100%），而12例停藥點(diǎn)HBV RNA低于檢測(cè)下限的CHB患者中僅有3例（25%）出現(xiàn)病毒反彈（P＜0.05），結(jié)果表明當(dāng)血清中HBV RNA陽(yáng)性時(shí)預(yù)示著停藥后發(fā)生病毒反彈和疾病復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)較高。

此外，筆者在32例接受PEG-IFN單獨(dú)治療或聯(lián)合NAs治療后實(shí)現(xiàn)血清HBsAg和HBV DNA均消失的CHB患者中發(fā)現(xiàn)，7例血清HBV RNA陽(yáng)性的患者在停用PEG-IFN后均發(fā)生了HBsAg和（或）HBV DNA陽(yáng)轉(zhuǎn)，而在25例血清HBV RNA檢測(cè)不到的患者中只有5例在停用PEG-IFN后發(fā)生了HBsAg和（或）HBV DNA陽(yáng)轉(zhuǎn)。這一結(jié)果表明，監(jiān)測(cè)血清HBV RNA水平也可預(yù)測(cè)經(jīng)抗病毒治療后實(shí)現(xiàn)HBsAg消失暨“臨床治愈”的CHB患者出現(xiàn)病毒反彈的風(fēng)險(xiǎn)。由于上述研究都是基于單中心的小樣本回顧性隊(duì)列研究，未來(lái)仍需多中心的大樣本前瞻性研究加以驗(yàn)證。

7  基于血清HBV RNA檢測(cè)的CHB臨床治愈精準(zhǔn)路徑

傳統(tǒng)的病毒學(xué)應(yīng)答是基于血清HBV DNA水平定義的，然而，由于NAs 治療可直接高效阻斷HBV rcDNA的生成，但并不直接影響pgRNA的生成，因此臨床上會(huì)出現(xiàn)經(jīng)NAs治療的CHB患者中血清HBV DNA很快消失，而相當(dāng)一部分患者的血清HBV RNA仍持續(xù)陽(yáng)性的情況。血清HBV RNA陽(yáng)性表明患者肝組織內(nèi)仍存在轉(zhuǎn)錄活躍的cccDNA。為了更加準(zhǔn)確的評(píng)估抗病毒效果，筆者建議病毒學(xué)應(yīng)答的檢測(cè)應(yīng)該納入血清HBV RNA的檢測(cè)，并應(yīng)重新定義為血清HBV DNA和HBV RNA均持續(xù)消失（低于檢測(cè)下限）。

此外，筆者團(tuán)隊(duì)以HBV RNA檢測(cè)為基礎(chǔ)修訂了“部分治愈”（partial cure）和“準(zhǔn)臨床治愈”（para-functional cure）的概念；其中修訂的“部分治愈”指的是CHB患者經(jīng)抗病毒治療后ALT恢復(fù)正常，血清HBV DNA和HBV RNA持續(xù)低于檢測(cè)下限，而此時(shí)的血清HBsAg水平仍較高；“準(zhǔn)臨床治愈”指的是在“部分治愈”的基礎(chǔ)上肝組織內(nèi)cccDNA已清除或處于持續(xù)的表達(dá)靜默狀態(tài)，但由于整合的病毒DNA片段可以持續(xù)低水平表達(dá)HBsAg，患者血清HBsAg仍可有低值陽(yáng)性。

以“準(zhǔn)臨床治愈”為基礎(chǔ)，筆者對(duì)CHB的抗病毒治療提出了優(yōu)化治療路徑的建議，其中建議對(duì)未達(dá)到“準(zhǔn)臨床治愈”的CHB患者繼續(xù)進(jìn)行NAs治療或聯(lián)合PEG-IFN治療，達(dá)到“準(zhǔn)臨床治愈”后則可以考慮停止NAs用藥，并進(jìn)行PEG-IFN的序貫治療，以期能夠使更多的CHB患者實(shí)現(xiàn)臨床治愈。通過(guò)CHB抗病毒治療階梯式“治愈”的建議，期望有助于推動(dòng)CHB臨床治愈的精準(zhǔn)治療路徑，最終有助于更多的CHB患者實(shí)現(xiàn)臨床治愈。