首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院
AP中的自噬過程發(fā)生改變
自噬受損主要表現(xiàn)為自噬流動態(tài)過程的完整性受損，可發(fā)生在自噬任何步驟，包括自噬體的形成減少或產(chǎn)生缺陷、與溶酶體融合發(fā)生障礙，或溶酶體蛋白水解酶活性功能低下。許多疾病都與自噬損傷有關(guān)，例如克羅恩病中自噬蛋白ATG16L1突變引起自噬體形成缺陷，與炎癥持續(xù)發(fā)生關(guān)系密切。
自噬早期（自噬體與溶酶體融合之前）和晚期（自噬體與溶酶體融合及之后）受損對細(xì)胞內(nèi)自噬泡數(shù)量產(chǎn)生相反的影響。早期抑制會引起自噬泡形成數(shù)量減少；而晚期抑制則會導(dǎo)致自噬體與溶酶體融合障礙，胞內(nèi)自噬體數(shù)量堆積，溶酶體內(nèi)蛋白酶活性也將受損，導(dǎo)致含有待降解物質(zhì)的自噬溶酶體積聚。研究發(fā)現(xiàn)AP中的自噬過程發(fā)生顯著改變。
2.1 AP中自噬受損
胰腺腺泡細(xì)胞中大液泡的積聚是人和實驗性AP的突出特征，研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的液泡都是自噬相關(guān)的。在腺泡細(xì)胞中AP時產(chǎn)生的液泡比饑餓刺激更多，而這些液泡也明顯更大；此外，AP的自噬液泡主要是自噬溶酶體。在多種AP模型中觀察到，大液泡的積累伴隨著LC3-Ⅱ水平的增加，與饑餓相比，AP大大降低了自噬效率，主要表現(xiàn)為長壽蛋白降解率降低和通過自噬途徑降解的泛素化蛋白受體p62（也稱SQSTM1）水平提高。液泡積累、自噬降解效率降低，以及LC3-Ⅱ和p62水平的提高，揭示了AP的自噬受損。此外，載著部分消化的待降解物質(zhì)的巨自噬溶酶體占主導(dǎo)地位，表明溶酶體水解活性受到損害。AP并不能阻止自噬體與溶酶體的融合，這一點體現(xiàn)在腺泡細(xì)胞中自噬溶酶體數(shù)量積聚，及與溶酶體共定位的標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ增加。而長期基礎(chǔ)水平自噬受損將會導(dǎo)致慢性胰腺炎的形成。
2.2 AP對自噬體生成的影響
胰腺炎并不能阻止自噬體的生成；與此相反，Gukovsky等發(fā)現(xiàn)自噬介導(dǎo)蛋白——液泡膜蛋白1在AP中是上調(diào)的。液泡膜蛋白1與腺泡細(xì)胞中的自噬誘導(dǎo)有關(guān)，主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，為AP表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)之一。它與自噬起始相關(guān)蛋白Beclin1相互作用，與LC3-Ⅱ能共定位，是自噬體生成的重要介質(zhì)。透射電鏡和免疫電鏡顯示自噬液泡具有自噬體的所有特征，如雙膜、LC3-Ⅱ和完整的大降解物質(zhì)。遺傳、分子和藥理學(xué)表明腺泡細(xì)胞中Atg5參與到自噬體的生成，表明自噬體形成是通過規(guī)范途徑進(jìn)行的。
2.3 AP中自噬體與LAMP減少
細(xì)胞腔面有多蛋白復(fù)合物保護(hù)LAMP在空間上與溶酶體酸性水解酶分離，以及其高度糖基化，避免了被裂解。多項研究發(fā)現(xiàn)AP中LAMP表達(dá)顯著減少，其降解并非由于去糖基化導(dǎo)致，而是通過組織蛋白酶（cathepsin, Cat)B介導(dǎo)的胞漿面近跨膜區(qū)域的斷裂 。研究推測，CatB的異常成熟使其在AP溶酶體中定位發(fā)生了改變，并與其他水解酶共同作用，導(dǎo)致LAMP發(fā)生降解。
研究發(fā)現(xiàn)，LAMP的缺乏也能導(dǎo)致AP。在LAMP-2基因敲除的小鼠胰腺中，胰腺腺泡細(xì)胞中形態(tài)異常的自噬泡的顯著聚集早在小鼠1個月大時便很突出，并且與進(jìn)行性胰腺腺泡細(xì)胞損傷有關(guān)。
2.4 AP中溶酶體酶活性異常介導(dǎo)了自噬溶酶體功能損傷
20多年前，Steer發(fā)現(xiàn)，實驗性AP導(dǎo)致了CatB活性顯著降低。在AP中組織蛋白酶加工受損，導(dǎo)致了成熟形態(tài)的減少，而以中間體和前體形式聚集增多。溶酶體組織蛋白酶的發(fā)育不全意味著激活缺陷，從而解釋了AP中溶酶體酶活性下降。Mareninova等發(fā)現(xiàn)這種下降并不局限于CatB，還發(fā)生在溶酶體水解酶CatL、CatD、天冬酰胺內(nèi)肽酶（或半胱氨酸蛋白酶）、芳基硫酸酯酶等，提示AP時溶酶體內(nèi)酶功能活性普遍下降。
Boonen等研究發(fā)現(xiàn)，功能失調(diào)的溶酶體水解酶，特別是組織蛋白酶，會引起小鼠腺泡細(xì)胞的自噬損傷。glcnac-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶由Gnptab和Gnptg基因編碼亞基，將修飾性M6P加到溶酶體的酸性水解酶上，這是水解酶的一種特異性識別信號，可將水解酶靶向轉(zhuǎn)運至溶酶體上。Gnptab基因敲除阻斷了組織蛋白酶從高爾基體到溶酶體的轉(zhuǎn)運，小鼠胰腺外分泌部溶酶體降解能力顯著下降，導(dǎo)致腺泡細(xì)胞自噬功能受損，表現(xiàn)為大量體積異常增大的含有未消化待降解物質(zhì)的自噬體堆積。
3 自噬功能異常在AP疾病發(fā)生發(fā)展中的作用
胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)胰蛋白酶原異常激活與炎癥反應(yīng)是胰腺炎疾病發(fā)生發(fā)展的重要機制，而自噬與二者皆密切相關(guān)。
3.1 自噬受損與腺泡細(xì)胞內(nèi)胰蛋白酶原激活
小鼠AP模型中，已確定了AP與自噬受損之間存在一定的關(guān)聯(lián)。這種自噬受損反應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)胰蛋白酶原激活有關(guān)。
Hashimoto等首次利用Atg5基因敲除小鼠建立AP模型，發(fā)現(xiàn)Atg5基因敲除后小鼠胰腺腺泡細(xì)胞自噬減少、胰蛋白酶原活性明顯降低、病情嚴(yán)重程度減輕。Mareninova等研究發(fā)現(xiàn)，AP并不能阻斷自噬體與核內(nèi)體/溶酶體的融合，但是能導(dǎo)致溶酶體關(guān)鍵酶CatL與CatB的加工（成熟）障礙，使得AP中組織蛋白酶向不成熟的形式傾斜，這種損傷可能是導(dǎo)致溶酶體清除蛋白功能不全及自噬流受損的重要原因。CatB能將胰蛋白酶原轉(zhuǎn)化為胰蛋白酶，但CatL并不會激活胰蛋白酶原，相反，會降低胰蛋白酶和胰蛋白酶原。CatL與CatB平衡失調(diào)導(dǎo)致胰腺腺泡細(xì)胞中胰蛋白酶上調(diào)，而胰蛋白酶原激活被認(rèn)為是AP發(fā)病的主要機制。然而，胰蛋白酶原基因敲除的小鼠仍然易發(fā)生AP，盡管腺泡細(xì)胞的損傷受到一定的保護(hù)作用，即胰蛋白酶激活并不是AP啟動的必須條件。
3.2 自噬受損與炎癥反應(yīng)
研究發(fā)現(xiàn)，自噬有直接清除微生物（微生物入侵、刺激固有免疫反應(yīng)，如上調(diào)Toll樣受體的表達(dá)，誘導(dǎo)自噬反應(yīng)，吞噬微生物至溶酶體中降解、控制炎癥和抗原反應(yīng)（自噬能夠通過清除受損線粒體、抑制炎癥小體的激活；自噬過程一旦受損，促炎介質(zhì)將發(fā)生清除障礙）、淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)（自噬能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)主要組織相容性復(fù)合體抗原遞呈、IL-1α等調(diào)控淋巴細(xì)胞的平衡及功能）及免疫介質(zhì)的分泌（自噬能夠通過調(diào)節(jié)分泌性蛋白合成途徑、胞質(zhì)中分泌性蛋白數(shù)量控制免疫介質(zhì)的分泌）等免疫學(xué)功能。炎癥反應(yīng)各階段的許多分子均受核因子-κB(NF-κB)調(diào)控，包括TNFα、IL-6、iNOS、趨化因子等。Yang等研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB活化增強胰腺腺泡細(xì)胞自噬。通過抑制重癥急性胰腺炎胰腺腺泡細(xì)胞自噬，能夠減輕炎癥反應(yīng)及胰腺炎的嚴(yán)重程度。上述研究提示AP中自噬與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。
3.3 假說
溶酶體/自噬功能異常是AP啟動的關(guān)鍵起始事件。Gukovskaya等提出溶酶體/自噬功能障礙是AP的關(guān)鍵啟動事件。在人和所有動物模型中，AP均出現(xiàn)明顯的自噬受損現(xiàn)象。溶酶體/自噬功能異常是疾病發(fā)展的早期事件。例如，溶酶體組織蛋白酶活性的抑制、LAMP的減少以及自噬功能受損在雨蛙素誘導(dǎo)的AP中30 min即出現(xiàn)，與AP的其他早期病理學(xué)反應(yīng)如胰蛋白酶原和NF-κB激活同時出現(xiàn)。
專門針對溶酶體或自噬功能的基因改變會引發(fā)類似于AP的損傷。在LAMP-2缺乏、溶酶體/自噬功能異常的小鼠引起自發(fā)性胰腺炎，表現(xiàn)有胰腺腺泡細(xì)胞空泡化、胰腺內(nèi)進(jìn)行性炎性浸潤和腺泡細(xì)胞壞死。在Gnptab基因敲除、組織蛋白酶運輸至溶酶體受阻的小鼠中，自噬流受損，導(dǎo)致胰腺炎反應(yīng)，如腺泡細(xì)胞空泡化、炎癥和胰腺組織結(jié)構(gòu)紊亂。2種M6P受體中的一種被敲除，可能會加強雨蛙素誘導(dǎo)的胰腺炎中的胰蛋白酶原的激活。
4 干預(yù)自噬探索AP治療潛在靶標(biāo)
Wan等發(fā)現(xiàn)自噬早期抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA）和誘導(dǎo)劑雷帕霉素可干擾自噬過程，調(diào)節(jié)NF-κB和caspase-1-IL-1β通路，減輕雨蛙素和左旋精氨酸誘導(dǎo)的BALB/c小鼠重癥AP模型中炎癥因子水平和多器官損傷。AP體外模型研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可從基因水平調(diào)節(jié)溶酶體蛋白（LAMP-2和組織蛋白酶）的表達(dá)，調(diào)節(jié)胰腺腺泡細(xì)胞自噬過程，影響胰酶的激活。傳統(tǒng)中藥治療AP自古已有，且療效明確。研究發(fā)現(xiàn)，五加屬、大黃素等中藥制劑，也能通過調(diào)節(jié)?；悄懰徕c誘導(dǎo)的大鼠AP模型胰腺腺泡細(xì)胞受損自噬，減輕炎癥和胰腺炎嚴(yán)重程度。對自噬過程各個環(huán)節(jié)的干預(yù)，能夠影響AP中炎癥通路和胰酶激活，進(jìn)而干擾胰腺炎發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，對臨床探索治療AP潛在靶標(biāo)具有重要的啟示意義。
5 展望
目前，對自噬功能障礙調(diào)控機制的理解中仍存在著許多空白。自噬在AP的起始事件中具體扮演什么樣的角色（是自噬誘導(dǎo)了AP，還是AP導(dǎo)致自噬異常）尚無研究結(jié)論。NF-κB途徑作為胰腺炎機制的一個重要參與者，引發(fā)炎癥反應(yīng)，但目前為止自噬與NF-κB路徑之間的聯(lián)系尚未闡明。AP中引起腺泡細(xì)胞中溶酶體/自噬功能異常的具體機制尚不明確。是否有其他途徑導(dǎo)致溶酶體退化（例如vATPase的病理改變導(dǎo)致的溶酶體內(nèi)pH值的變化）、組織蛋白酶在胰腺炎的病理作用、是否存在其他溶酶體水解酶的參與以及胰腺炎的LAMP降解機制是什么等關(guān)鍵問題，均有待進(jìn)一步的探究。
闡明自噬功能障礙的分子機制將有助于深入了解治療AP或減輕其嚴(yán)重程度的潛在分子靶標(biāo)。面臨的挑戰(zhàn)將是如何使這些途徑“正?；?，使紊亂的自噬通路恢復(fù)，發(fā)揮其積極的作用，而不是簡單地刺激或阻止自噬。由于溶酶體的降解存在缺陷，刺激AP的自噬可能會加劇細(xì)胞內(nèi)代謝通路的紊亂。這也許可以解釋為什么通過敲除Atg5基因（或siRNA）或3-MA來抑制自噬，能夠起到改善雨蛙素誘導(dǎo)的AP的作用。然而，長期的自噬抑制對于機體來說可能是有害的，即AP的后期恢復(fù)階段。
引證本文：李春云, 劉瑞霞, 陰赪宏. 自噬在急性胰腺炎發(fā)生發(fā)展中的作用[J]. 臨床肝膽病雜志, 2019, 35(5): 1157-1160.
