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核酸中含有嘌呤和嘧啶，具有能強(qiáng)烈吸收紫外光的共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，使核酸顯示特定的紫外光吸收光譜，高峰為260納米,低峰為230納米。

1.紫外可見吸收光譜：

分子價(jià)電子能級(jí)躍遷。 

波長(zhǎng)范圍：100-800 nm.

(1) 遠(yuǎn)紫外光區(qū): 100-200nm  

(2) 近紫外光區(qū): 200-400nm 

(3)可見光區(qū):400-800nm

可用于結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。

與紫外可見吸收光譜相關(guān)的分子內(nèi)部三種運(yùn)動(dòng)形式： 

（1）電子相對(duì)于原子核的運(yùn)動(dòng)：電子能級(jí) 

（2）原子核在其平衡位置附近的相對(duì)振動(dòng)：振動(dòng)能級(jí) 

（3）分子本身繞其重心的轉(zhuǎn)動(dòng)：轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)

三種能級(jí)都是量子化的，且各自具有相應(yīng)的能量

分子的內(nèi)能：電子能量Ee 、振動(dòng)能量Ev 、轉(zhuǎn)動(dòng)能量Er

即：

電子躍遷相關(guān)的能級(jí)躍遷的能量差（E=h c/λ)

（1）轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的能量差ΔEr：0.005～0.050eV，躍遷產(chǎn)生吸收光譜位于遠(yuǎn)紅外區(qū)。遠(yuǎn)紅外光譜或分子轉(zhuǎn)動(dòng)光譜。

（2）振動(dòng)能級(jí)的能量差ΔEv約為：0.05～１eV，躍遷產(chǎn)生的吸收光譜位于紅外區(qū)，紅外光譜或分子振動(dòng)光譜。

（3）電子能級(jí)的能量差ΔEe較大1～20eV。

電子躍遷產(chǎn)生的吸收光譜在 

紫外—可見光區(qū)

紫外—可見光譜或分子的電子光譜

能級(jí)躍遷

紫外-可見光譜屬于電子躍遷光譜。

 電子能級(jí)間躍遷的同時(shí)總伴隨有振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的躍遷，呈現(xiàn)帶狀光譜帶。

分子吸收光譜是帶狀光譜 

分子在吸收過程中發(fā)生電子能級(jí)躍遷的同時(shí)伴隨振動(dòng) 能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的能量變化。

一般原子對(duì)電磁輻射的吸收只涉及原子核外電子能量的變化，是一些分離的特征銳線，而分子的吸收光譜是由成千上萬條彼此靠得很緊的譜線組成， 看起來是一條連續(xù)的吸收帶。

電子能級(jí)的躍遷產(chǎn)生的吸收光譜， 包含了大量的譜線，這些譜線的重疊而成為連續(xù)的吸收帶，且由于絕大多數(shù)分子光譜分析，都是用液體樣品，加之儀器的分辨率有限，因而所記錄的分子光譜為帶狀光譜。

2. 物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收及吸收曲線

量子化 ；選擇性吸收。

分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性使其對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸收程度不同； 

用不同波長(zhǎng)的單色光照射， 測(cè)吸光度— 吸收曲線與最大吸波長(zhǎng)λmax； 

光的互補(bǔ)：藍(lán)?黃

（1）同一種物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸光度不同。吸光度最大處對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)稱為最大吸收波長(zhǎng)，記為λmax。 

（2）不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線形狀相同，λmax 不變。不同物質(zhì)的的吸收曲線形狀和λmax一般不同。因此，吸收曲線是物質(zhì)定性分析的依據(jù)之一，可提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，也是定量分析中選擇入射光波長(zhǎng)的依據(jù)。 

（3）不同濃度的同一種物質(zhì)，在某一定波長(zhǎng)下吸光度是不同的，吸光度大小是物質(zhì)定量分析的依據(jù)。在λmax處吸光度A的變化最大，測(cè)定靈敏度最高。

金屬配合物的生色機(jī)理主要有三種類型：

1） 金屬離子微擾的配位體內(nèi)電子躍遷

金屬離子的微擾，將引起配位體吸收波長(zhǎng)和強(qiáng)度的變化。變化與成 鍵性質(zhì)有關(guān)，若靜電引力結(jié)合，變化一般很小。若共價(jià)鍵和配位鍵結(jié)合， 則變化非常明顯。 

2）配位體微擾的金屬離子d一d電子躍遷和ｆ一ｆ電子躍遷

含d電子的過渡金屬離子躍遷會(huì)產(chǎn)生配位體場(chǎng)吸收帶。依據(jù)配位場(chǎng)理論，無配位場(chǎng)存在時(shí)，能量簡(jiǎn)并；當(dāng)過渡金屬離子處于配位體形成的負(fù)電場(chǎng)中時(shí)，5個(gè)簡(jiǎn)并的d軌道會(huì)分裂成能量不同的軌道。不同配位體場(chǎng)， 如八面體場(chǎng)、四面體場(chǎng)、 正方平面配位場(chǎng)等使能級(jí)分裂不等。

一般配位體場(chǎng)吸收帶在可見區(qū)，εmax～0.1-100，吸收很弱。因此配位體場(chǎng)吸收帶對(duì)定量分析用處不大。雖然配位體躍遷在定量分析應(yīng)用上不如電荷轉(zhuǎn)移躍遷重要，但它可用于研究配合物的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)。

某些過渡金屬離子的吸光度

3）電荷轉(zhuǎn)移躍遷

當(dāng)吸收紫外可見輻射后，分子中原定域在金屬M(fèi)軌道上電荷的轉(zhuǎn)移到配位體L的軌道，或按相反方向轉(zhuǎn)移，這種躍遷稱為電荷轉(zhuǎn)移躍遷，所產(chǎn)生的吸收光譜稱為荷移光譜。 

電荷轉(zhuǎn)移躍遷本質(zhì)上屬于分子內(nèi)氧化還原反應(yīng)，因此呈現(xiàn)荷移光譜的必要條件是構(gòu)成分子的二組分，一個(gè)為電子給予體， 另一個(gè)應(yīng)為電子接受體。 

電荷轉(zhuǎn)移吸收帶涉及的是給體的一個(gè)電子向受體的一個(gè)電子軌道上的躍遷，激發(fā)態(tài)是這一內(nèi)氧化還原過程的產(chǎn)物。

電荷轉(zhuǎn)移過程可表示如下：

式中D與A分別代表電子給體與受體。

下面三例是能產(chǎn)生電荷轉(zhuǎn)移吸收帶的一些化合物 。

 Fe3＋與SCN－形成血紅色配合物，在490nm處有強(qiáng)吸收峰。

其實(shí)質(zhì)是：

Fe3+ 電子受體， SCN- 電子給體

荷移光譜的最大吸收波長(zhǎng)及吸收強(qiáng)度與電荷轉(zhuǎn)移的難易程度有關(guān)。電荷轉(zhuǎn)移吸收帶出現(xiàn)于紫外區(qū)或可見區(qū)，一個(gè)特點(diǎn)是吸收強(qiáng)度大，εmax >

1.朗伯—比耳定律

· 布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年闡明了光的吸收程度和吸收層厚度的關(guān)系。A∝b

· 1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物濃度之間也具有類似的關(guān)系。A∝ c

· 二者的結(jié)合稱為朗伯—比耳定律，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：

透光度(透光率)T 透過度T  

描述入射光透過溶液的程度:

吸光度A與透光度T的關(guān)系:

朗伯—比耳定律是吸光光度法的理論基礎(chǔ)和定量測(cè)定的依據(jù)。應(yīng)用于各種光度法的吸收測(cè)

量； 

摩爾吸光系數(shù)ε在數(shù)值上等于濃度為1 mol/L、液層厚度為1cm時(shí)該溶液在某一波長(zhǎng)下的吸光度； 

吸光系數(shù)a(L·g-1·cm-1）相當(dāng)于濃度為1 g/L、液層厚度為1cm時(shí)該溶液在某一波長(zhǎng)下的吸光度。

2.摩爾吸光系數(shù)ε的討論 

（1）吸收物質(zhì)在一定波長(zhǎng)和溶劑條件下的特征常數(shù)； 

（2）不隨濃度c和光程長(zhǎng)度b的改變而改變。在溫度和波長(zhǎng)等條件一定時(shí)，ε僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)； 

（3）可作為定性鑒定的參數(shù)； 

（4）同一吸收物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的ε值是不同的。在最大吸收波長(zhǎng)λmax 處的摩爾吸光系數(shù)，常以εmax表示。εmax表明了該吸收物質(zhì)最大限度的吸光能力，也反映了光度法測(cè)定該物質(zhì)可能達(dá)到的最大靈敏度。 

（5）εmax越大表明該物質(zhì)的吸光能力越強(qiáng)，用光度法測(cè)定該物質(zhì)的靈敏度越高。

ε>

3.偏離朗伯—比耳定律的原因 

標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定未知溶液的濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線常發(fā)生彎曲（尤其當(dāng)溶液濃度較高時(shí)），這種現(xiàn)象稱為對(duì)朗伯—比耳定律的偏離。

引起偏離的因素： 

（1）物理性因素

非單色光、雜散光、非平行入射光都會(huì)引起對(duì)朗伯—比耳定律的偏離，最主要的是非單色光作為入射光引起的偏離。

朗—比耳定律的前提條件之一是入射光為單色光。分光光度計(jì)只能獲得近乎單色的狹窄光帶,難以獲得真正的純單色光。復(fù)合光可導(dǎo)致對(duì)朗伯—比耳 定律的正或負(fù)偏離。

非單色光作為入射光引起的偏離 

假設(shè)由波長(zhǎng)為λ1和λ2的兩單色光 ，組成的入射光通過濃度為c的溶液，則：

討論:

(2) 化學(xué)性因素

朗—比耳定律的假定：所有的吸光質(zhì)點(diǎn)之間不發(fā)生相互作用；假定只有在稀溶液(c<

故：朗伯—比耳定律只適用于稀溶液。

溶液中存在著離解、聚合、互變異構(gòu)、配合物的形成等化學(xué)平衡時(shí) 。使吸光質(zhì)點(diǎn)的濃度發(fā)生變化，影響吸光度。 

例：鉻酸鹽或重鉻酸鹽溶液中存在下列平衡： 

溶液中

4. 吸光度A或透光率T的實(shí)驗(yàn)測(cè)定

設(shè)入射光I通過含有吸光質(zhì)的液體樣品

5. 多吸光質(zhì)的朗伯—比耳定律 

若樣品中包含多種吸光物質(zhì)，朗伯—比耳定律可表述為：

含義：樣品的吸光度是各種吸光質(zhì)的吸光度的和

1.光源

在整個(gè)紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長(zhǎng)的使用壽命。 

可見光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長(zhǎng)范圍在320～2500 nm。 

紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射185～ 400 nm的連續(xù)光譜。

2.單色器

將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出一任波長(zhǎng)單色光的光學(xué)系統(tǒng)。 

①入射狹縫：光源的光由此進(jìn)入單色器； 

②準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束； 

③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵； 

④聚焦裝置：透鏡 或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫； 

⑤出射狹縫。

3. 樣品室

樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用 石英池，可見區(qū)一般用玻璃池。

4. 檢測(cè)器 

利用光電效應(yīng)將透過吸收池的光信號(hào)變成可測(cè)的電信號(hào)， 如：光電池、光電管、光電二極管或光電倍增管(目前常用)。

5.分光光度計(jì)的類型

單光束

簡(jiǎn)單，價(jià)廉，適于在給定波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測(cè)器具有很高的穩(wěn)定性。 

雙光束 

自動(dòng)記錄，快速全波段掃描?？上庠床环€(wěn)定、檢測(cè)器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復(fù)雜，價(jià)格較高。

雙波長(zhǎng) 

將不同波長(zhǎng)的兩束單色光(λ1、λ2) 快束交替通過同一吸收池而后到達(dá)檢測(cè)器。產(chǎn)生交流信號(hào)。無需參比池?！鳓?1～2nm。兩波長(zhǎng)同時(shí)掃描即可獲得導(dǎo)數(shù)光譜。

顯色反應(yīng)：被測(cè)組分轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩衔锏姆磻?yīng)

顯色反應(yīng)的選擇

1.對(duì)顯色反應(yīng)的要求

· 選擇性好，顯色條件易于控制，重現(xiàn)性好； 

· 靈敏度高，一般ε>

· 生成的顯色化合物穩(wěn)定； 

· 顯色化合物與顯色劑的顏色差異大，顯色劑在測(cè)定波長(zhǎng)處無明顯吸收。 

兩種有色物最大吸收波長(zhǎng)之差：“對(duì)比度”，要求△λ >  60nm。

2. 金屬離子顯色反應(yīng)的類型 

（1）氧化還原反應(yīng)： 

某些元素的氧化態(tài)，如Mn（Ⅶ）、Cr（Ⅵ）在紫外或可見光區(qū)能強(qiáng)烈吸收，可利用氧化還原反應(yīng)對(duì)待測(cè)離子進(jìn)行顯色后測(cè)定。

例如：鋼中微量錳的測(cè)定，是將Mn2＋ 氧化成紫紅色的MnO4-后，在525 nm 處進(jìn)行測(cè)定。 

（2）配位顯色反應(yīng) 

當(dāng)金屬離子與有機(jī)顯色劑形成配合物時(shí)，通常會(huì)發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移躍遷， 產(chǎn)生很強(qiáng)的紫外—可見吸收光譜。

3.金屬離子顯色劑 

無機(jī)顯色劑：硫氰酸鹽、鉬酸銨、過氧化氫等幾種。 

有機(jī)顯色劑：種類繁多 

偶氮類顯色劑：本身是有色物質(zhì)，生成配合物后，顏 色發(fā)生明顯變化；具有性質(zhì)穩(wěn)定、顯色反應(yīng)靈敏度高、選擇性好、對(duì)比度大等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用最廣泛。偶氮胂Ⅲ、PAR等。 

三苯甲烷類：鉻天青S、二甲酚橙等

顯色反應(yīng)條件的選擇（單因素試驗(yàn)法）

1.顯色劑用量

吸光度A與顯色劑用量CR的關(guān)系會(huì)出現(xiàn)如圖所示的幾種情況。

選擇曲線變化平坦處。

2.反應(yīng)體系的酸度

在相同實(shí)驗(yàn)條件下，分別測(cè)定不同pH值條件下顯色溶液的吸光度。選擇曲線中吸光度較大且恒定的平坦區(qū)所對(duì)應(yīng)的pH范圍。

3.顯色時(shí)間與溫度

實(shí)驗(yàn)確定

4.溶劑

一般盡量采用水相測(cè)定。

共存離子干擾的消除

1.加入掩蔽劑

選擇掩蔽劑的原則是：掩蔽劑不與待測(cè)組分反應(yīng)；掩蔽劑本身及掩蔽劑與干擾組分的反應(yīng)產(chǎn)物不干擾待測(cè)組分的測(cè)定。

2. 選擇適當(dāng)?shù)娘@色反應(yīng)條件

3. 分離干擾離子

測(cè)定條件的選擇

1.選擇適當(dāng)?shù)娜肷洳ㄩL(zhǎng)

一般應(yīng)該選擇λmax為入射光波長(zhǎng)。如果λmax處有共存組分干擾時(shí)，則應(yīng)考慮選擇靈敏度 稍低但能避免干擾的入射光波長(zhǎng)。

2.選擇合適的參比溶液 

為什么需要使用參比溶液？ 

測(cè)得的的吸光度真正反映待測(cè)溶液吸光強(qiáng)度。 

參比溶液的選擇一般遵循以下原則： 

（1）若僅待測(cè)組分與顯色劑反應(yīng)產(chǎn)物在測(cè)定波長(zhǎng)處有吸收，其它所加試劑均無吸收，用純?nèi)軇ㄋ?作參比溶液； 

（2）若顯色劑或其它所加試劑在測(cè)定波長(zhǎng)處略有吸收，而試液本身無吸 收，用“試劑空白”(不加試樣溶液)作參比溶液； 

（3）若待測(cè)試液在測(cè)定波長(zhǎng)處有吸收，而顯色劑等無吸收，則可用“試樣空白”(不加顯色劑)作參比溶液； 

（4）若顯色劑、試液中其它組分在測(cè)量 波長(zhǎng)處有吸收，則可在試液中加入適當(dāng) 掩蔽劑將待測(cè)組分掩蔽后再加顯色劑， 作為參比溶液。

3.控制適宜的吸光度（讀數(shù)范圍） 

不同的透光度讀數(shù)，產(chǎn)生的誤差大小不同：

最佳讀數(shù)范圍與最佳值

設(shè)：ΔT =1%，則可繪出溶液濃度

相對(duì)誤差Δc/c與其透光度T 的關(guān)系曲線。

如圖所示：

當(dāng)：ΔT =1%，T 在20%～65%之間時(shí)，濃度相對(duì)誤差較小，最佳讀數(shù)范圍。

用儀器測(cè)定時(shí)應(yīng)盡量使溶液透光度值在T %=20～65% 

吸光度 A =0.70～0.20。

可求出濃度相對(duì)誤差最小時(shí)的透光度Tmin為：

Tmin＝36.8%, Amin＝0.434

普通分光光度法

1.單組分的測(cè)定

通常采用 A-C 標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測(cè)定。

2.多組分的同時(shí)測(cè)定

 ⑴ 若各組分的吸收曲線互不重疊，則可在各自最大吸收波長(zhǎng)處分別進(jìn)行測(cè)定。這本質(zhì)上與單組分測(cè)定沒有區(qū)別。

 ⑵ 若各組分的吸收曲線互有重疊，則可根據(jù)吸光度的加合性求解聯(lián)立方程組得出各組分的含量。

示差分光光度法（示差法）

普通分光光度法一般只適于測(cè)定微量組分，當(dāng)待測(cè)組分含量較高時(shí) ，將產(chǎn)生較大的誤差。需采用示差法。即并采用濃度稍低于待測(cè)溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比溶液。

測(cè)得的吸光度相當(dāng)于普通法中待測(cè)溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度之差ΔＡ 。

測(cè)得的吸光度相當(dāng)于普通法中待測(cè)溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度之差ΔA 。

示差法測(cè)得的吸光度與Δc呈直線關(guān)系。由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的Δc值，則待測(cè)溶液濃度Cx ：

示差法標(biāo)尺擴(kuò)展原理： 

普通法：Cs的T=10%；Cx的T=5% 

示差法：Cs 做參比，調(diào)T=100% 

則：Cx的T=50% ；標(biāo)尺擴(kuò)展10倍

即：T標(biāo)尺擴(kuò)展幾倍，濃度測(cè)定誤差縮小幾倍