前面給大家介紹了外泌體相關(guān)的文獻(xiàn)，看過(guò)那2篇文章后你應(yīng)該對(duì)外泌體相關(guān)的研究有了大概的了解（每周文獻(xiàn)精讀，通過(guò)這篇論文入門外泌體研究；節(jié)約時(shí)間成本，一文掌握4大熱點(diǎn)的研究套路），今天繼續(xù)跟大家讀一篇外泌體相關(guān)的文獻(xiàn)，這篇文章同樣綜合了多個(gè)熱點(diǎn)，包括干細(xì)胞、外泌體、小分子RNA和生信分析，也是一篇非常適合學(xué)習(xí)的參考文獻(xiàn)。
這篇文獻(xiàn)題目是：
Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomal MicroRNA-126-3p Inhibits Pancreatic Cancer Development by Targeting ADAM9.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體MicroRNA-126-3p通過(guò)靶基因ADAM9抑制胰腺癌發(fā)展。文章2019年發(fā)表在《Molecular Therapy Nucleic Acids》，影響因子是5.919。
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先來(lái)看研究背景：
主要交待了幾個(gè)方面的內(nèi)容：1. 胰腺癌的背景2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在胰腺癌治療中的潛力；3. BMSCs來(lái)源的外泌體攜帶的miRNA在腫瘤中的作用；4.miR-126-3p在腫瘤中的作用；5.本研究的目的主要是研究BMSCs來(lái)源外泌體攜帶的miR-126-3p在胰腺癌中的作用。
研究方法：
作者首先是進(jìn)行了GEO數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘篩選差異基因，利用miRNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)靶基因。然后在體外培養(yǎng)了胰腺癌細(xì)胞，并收集了28個(gè)胰腺癌患者的組織和32個(gè)胰腺炎患者的組織樣本。通過(guò)質(zhì)粒慢病毒轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞分別過(guò)表達(dá)或沉默miR-126-3p、沉默ADAM9，用雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)驗(yàn)證miR-126-3p和ADAM9的關(guān)系，做了Edu染色和Transwell遷移試驗(yàn)檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在體外培養(yǎng)BMSCs，提取外泌體并進(jìn)行電鏡觀察、NTA分析和乙酰膽堿酯酶活性檢測(cè)（AChE）。將胰腺癌細(xì)胞和BMSCs共培養(yǎng)，共聚焦顯微鏡觀察，PCR和Western-blot檢測(cè)相關(guān)RNA和蛋白表達(dá)。最后做了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行BMSCs裸鼠體內(nèi)移植。
我們來(lái)看研究結(jié)果
1.生信數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)ADAM9是miR-126-3p的靶基因。
主要是分析了GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的胰腺癌基因表達(dá)譜，做了韋恩圖，用R軟件limma包分析得到了GEO樣本共有的差異表達(dá)基因ADAM9,然后通過(guò)5個(gè)miRNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站（TargetScan , miRSearch, miRTarBase, miRWalk ,mirDIP；這幾個(gè)網(wǎng)站的網(wǎng)址文中都作了注明）預(yù)測(cè)了miRNA的靶基因，發(fā)現(xiàn)ADAM9是miR-126-3p的靶基因，用了GEPIA平臺(tái)分析ADAM9基因表達(dá)和胰腺癌患者生存率之間的相關(guān)性，
2.胰腺癌組織中miR-126-3p的表達(dá)是下降的。主要是用PCR檢測(cè)了胰腺癌細(xì)胞和組織中miR-126-3p的表達(dá)。
3.過(guò)表達(dá)miR-126-3p能抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)代謝。這里面主要是分了4個(gè)組，miR-126-3p過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組、miR-126-3p沉默組和對(duì)照組，Edu檢測(cè)增殖、Transwell試驗(yàn)檢測(cè)遷移和侵襲,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率。
4.雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)、PCR和WB驗(yàn)證了ADAM9是miR-126-3p的直接靶基因。主要通過(guò)沉默或過(guò)表達(dá)胰腺癌細(xì)胞中的miR-126-3p，檢測(cè)ADAM9的表達(dá)變化。
5.發(fā)現(xiàn)miR-126-3p是通過(guò)負(fù)調(diào)控ADAM9抑制胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能。分了4個(gè)組，空白轉(zhuǎn)染組、miR-126-3p抑制劑+空白轉(zhuǎn)染組、ADAM9轉(zhuǎn)染沉默組、miR-126-3p抑制劑+ADAM9轉(zhuǎn)染沉默組，檢測(cè)了胰腺癌的細(xì)胞代謝、增殖、遷移和侵襲功能。
6. BMSCs的培養(yǎng)和鑒定。
7.證明了BMSCs來(lái)源的外泌體攜帶了miR-126-3p。包括了外泌體的提取和鑒定（電鏡觀察、NTA分析和WB檢測(cè)標(biāo)記物）；通過(guò)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)BMSCs中miR-126-3p并進(jìn)行紅色熒光標(biāo)記，然后與pCDNA3.1-GFP熒光轉(zhuǎn)染標(biāo)記的胰腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)，在共聚焦顯微鏡下能觀察到胰腺癌細(xì)胞中有紅色標(biāo)記的miR-126-3p，用PCR檢測(cè)了BMSCs、外泌體和胰腺癌細(xì)胞中miR-126-3p的表達(dá)，并用PCR和WB檢測(cè)了胰腺癌細(xì)胞中ADAM9的表達(dá)。
8.外泌體釋放抑制劑GW4869通過(guò)抑制BMSCs外泌體的釋放（通過(guò)AChE檢測(cè)）抑制了胰腺癌細(xì)胞中miR-126-3p的表達(dá)，促進(jìn)了胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。
9. BMSCs來(lái)源外泌體通過(guò)傳遞miR-126-3p影響胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能。
通過(guò)過(guò)表達(dá)BMSCs中的miR-126-3p,然后與胰腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)，通過(guò)Edu檢測(cè)增殖、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率、Transwell試驗(yàn)檢測(cè)遷移和侵襲、WB檢測(cè)細(xì)胞增殖和侵襲因子（MMP-14、COX2、VEGF、Ki67）等方法檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞的功能變化。
10.過(guò)表達(dá)miR-126-3p抑制了胰腺癌的腫瘤增長(zhǎng)和代謝。這部分就是動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)，把經(jīng)過(guò)miR-126-3p過(guò)表達(dá)處理的BMSCs移植到裸鼠體內(nèi)，檢測(cè)腫瘤的組織變化和相關(guān)因子（ADAM9、MMP-14、COX2）的表達(dá)。
11. 研究結(jié)果總結(jié)。作者最后畫(huà)了一個(gè)漂亮的機(jī)制圖來(lái)展示本研究的結(jié)果。
結(jié)果總結(jié)：
本研究表明，BMSCs來(lái)源的外泌體可以通過(guò)傳遞miR-126-3p靶向抑制ADAM9的表達(dá)，從而抑制胰腺癌的進(jìn)展。
從這篇文章來(lái)看，重點(diǎn)要學(xué)習(xí)的幾個(gè)點(diǎn)：
1. 生信數(shù)據(jù)挖掘分析：GEO數(shù)據(jù)挖掘找差異基因，韋恩圖制作，limma R包分析差異基因，5個(gè)miRNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站
2. 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)：確定miRNA和預(yù)測(cè)的靶基因之間的直接關(guān)系
3. 細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)：BMSCs與疾病細(xì)胞的共培養(yǎng)
4. 外泌體釋放抑制的方法，可以用抑制劑GW4869抑制細(xì)胞外泌體的釋放。
5. 外泌體傳遞miRNA的研究套路：BMSCs中的miRNA沉默與過(guò)表達(dá)，目的細(xì)胞靶基因的轉(zhuǎn)染沉默。
6. 機(jī)制模式圖的繪制：一張圖總結(jié)研究結(jié)果，可以給你的文章加分很多。
這篇文章如果凝練成基金課題，可以用下面的題目：
BMSCs外泌體傳遞miR-126-3p靶向調(diào)控ADAM9抑制胰腺癌進(jìn)展的機(jī)制研究
如果想做大一點(diǎn)可以把ADAM9去掉，變成下面的題目：
BMSCs外泌體傳遞miR-126-3p抑制胰腺癌進(jìn)展的機(jī)制研究
今天的分享就到這里了。下期再見(jiàn)。
本文作者
逍遙君：南京醫(yī)科大學(xué)博士，主治醫(yī)師，發(fā)表論文20余篇，第一作者或通訊作者SCI論文8篇，主持國(guó)自然及各級(jí)別課題多項(xiàng)，著有《逍遙君說(shuō)科研系列課程》，主講Meta分析、基金標(biāo)書(shū)、論文寫(xiě)作，丁香園、募格學(xué)術(shù)特約講師，同時(shí)具有多年基金、股市、P2P、數(shù)字貨幣投資經(jīng)驗(yàn)。
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