今天是非腫瘤生信分析第二期，看完昨天的第一期「特納綜合征」，是不是覺得非腫瘤也蠻容易的呀！那咱們就來瞧瞧發(fā)表在Am J Transl Re（IF：3.266）雜志上的這一篇文章Integrated bioinformatics analysis identifies microRNA-376a-3p as a new microRNA biomarker in patient with coronary artery disease。作者從GEO數(shù)據(jù)庫下載了冠狀動(dòng)脈疾病CAD樣本和健康對(duì)照組的微陣列分析原始數(shù)據(jù)，包括mRNA和miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)集。利用生物信息學(xué)分析方法篩到了有效的生物標(biāo)志物！
冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)是全球主要的健康問題，發(fā)病率高，死亡率高。盡管在治療方面取得了許多進(jìn)展，但CAD患者的預(yù)后仍然很差。因此，本研究旨在識(shí)別與冠心病進(jìn)展相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物和靶標(biāo)。
A/B圖：熱圖顯示了來源于 GSE12288/GSE20681的CAD樣本和健康對(duì)照組的mRNA表達(dá)譜
C/D圖：鑒定DEGs的火山圖
分別篩選出1471個(gè)DEGs(759個(gè)下調(diào)和712個(gè)上調(diào)的mRNA)， 5584個(gè)DEGs(2729個(gè)下調(diào)和1855個(gè)上調(diào)的mRNA)
E圖：Venn圖取交集
篩選出來自兩個(gè)獨(dú)立的數(shù)據(jù)集150個(gè)DEGs(79個(gè)下調(diào)，71個(gè)上調(diào))。
A圖：GO富集分析
DEGs在“miRNA結(jié)合”和“轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合”等分子功能顯著富集。
B圖：KEGG通路分析
DEGs主要富集于“酒精中毒”和“病毒致癌”等通路。
圖A：用IPA軟件對(duì)最典型的通路進(jìn)行的top20排序。
最顯著的典型通路包括“RAR激活”、“AMPK信號(hào)通路”、“造血祖細(xì)胞中FLT3信號(hào)通路”和“LPS激活的MAPK信號(hào)通路”（表1）。
圖B：利用IPA進(jìn)行疾病和生物功能富集分析，并進(jìn)行了top20排名。
主要在“細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞生長和增殖”、“機(jī)體損傷和異常、生殖系統(tǒng)疾病”、“細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞生長和增殖”等功能富集（表2）。
以上結(jié)果表明，DEGs可能通過多種信號(hào)通路調(diào)控CAD的進(jìn)展。
與上述DEGs的篩選類似，作者選用了另外兩個(gè)GEO數(shù)據(jù)集篩選了DEMs（差異表達(dá)的miRNA）
圖A/B：GSE59421/GSE105449鑒定DEMs的熱圖
圖C/D：鑒定DEMs的火山圖
兩數(shù)據(jù)集對(duì)應(yīng)篩選出69個(gè)DEMs(30個(gè)下調(diào)和39個(gè)上調(diào))；26個(gè)DEMs(21個(gè)下調(diào)和5個(gè)上調(diào))
圖E：VENN圖取交集
圖A：將DEGs和miRNA靶基因取交集篩選重疊失調(diào)基因的流程展示。
圖B：構(gòu)建重疊失調(diào)基因與5個(gè)DEMs的相互作用網(wǎng)絡(luò)：
鑒定出43對(duì)DEMs與其靶基因之間的調(diào)控對(duì)，其中包括has-miR-376a-3p-NRIP1；
FN1、CREB1、NRIP1、PAFAH1B1、STAT5A、FKBP1A等6個(gè)基因被鑒定為hub基因（表3）。
圖C：ROC分析來評(píng)估CAD患者與健康對(duì)照組之間的miR-376a-3p表達(dá)情況：
AUC為0.651，具有較好的預(yù)測性能。
圖A：miR-376a-3p模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染進(jìn)HUVECs，檢測HUVECs中miR-376a-3p的水平。
轉(zhuǎn)染miR-376a-3p模擬物后，HUVECs中miR-376a-3p水平顯著升高；
轉(zhuǎn)染miR-376a-3p抑制劑后，細(xì)胞中miR-376a-3p水平顯著降低。
圖B：HUVECs轉(zhuǎn)染miR-376a-3p模擬物或抑制劑，用CCK-8法測定
過表達(dá)miR-376a-3p顯著增加HUVECs增殖
圖C/D：免疫熒光分析
miR-376a-3p抑制劑明顯抑制HUVECs的增殖
為了進(jìn)一步探討miR-376a在CAD中的作用，作者采用了流式細(xì)胞術(shù)。如圖7A、7B、7B所示，與NC組相比，miR-376a-3p inhibitor明顯誘導(dǎo)HUVECs凋亡。此外，western blotting分析顯示，與NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-376a-3p抑制劑后，HUVECs中Bax和cleaved caspase 3的表達(dá)明顯增加，而p-p65的表達(dá)明顯下降(圖7C-F)。這些結(jié)果提示，miR-376a-3p的下調(diào)可以誘導(dǎo)HUVECs的凋亡。
圖A/B：流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率
與NC組相比，miR-376a-3p抑制劑組誘導(dǎo)HUVECs凋亡顯著。
圖C：western blotting分析檢驗(yàn)Bax、cleaved caspase 3、p-p65的表達(dá)水平
圖D-F：Bax、cleaved caspase 3、p-p65蛋白的表達(dá)對(duì)比:
與NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-376a-3p抑制劑后，HUVECs中Bax和cleaved caspase 3的表達(dá)顯著增加，而p-p65的表達(dá)顯著下降。
這些結(jié)果提示，miR-376a-3p的下調(diào)可以誘導(dǎo)HUVECs的凋亡。
圖A：miR-376a-3p與NRIP1 WT區(qū)域內(nèi)假定結(jié)合位點(diǎn)的序列比對(duì)
在線生信工具miRWalk、RNA22和TargetScan表明NRIP1可能是miR-376a-3p的潛在靶點(diǎn)。
圖B：使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測NRIP1-WT/MT 3’-UTR質(zhì)粒和miR-376-3p模擬物共轉(zhuǎn)染HUVECs后的熒光素酶活性
miR-376a-3p模擬物可以抑制psiCHECK-2-NRIP1-WT的熒光素酶活性，但不影響psiCHECK-2-NRIP1-MT的熒光素酶活性。
圖C: HUVECs 72 h, RT-qPCR檢測HUVECs中NRIP1的水平
轉(zhuǎn)染miR-376a-3p模擬物后，HUVECs中的NRIP1水平顯著下調(diào)
圖D：Western blotting
過表達(dá)mir-376-a-3-p時(shí)，NRIP1的水平降低；p-p65、p-IκB、β-actin的水平增加
圖E-G：NRIP1、p-p65、β-actin的相對(duì)表達(dá)
這些結(jié)果表明過表達(dá)miR-376a-3p通過下調(diào)NRIP1促進(jìn)HUVECs生長。
小結(jié)
通過整合GEO數(shù)據(jù)集，篩選出了DEGs、DEMs。接著識(shí)別CAD中失調(diào)miRNA的靶基因。然后用在線生信工具預(yù)測DEMs的靶基因。然后取交集成功篩選到重疊的失調(diào)基因。接著進(jìn)一步明確miRNA靶基因與重疊失調(diào)基因之間的相互作用，共鑒定出43對(duì)含有5個(gè)常見DEMs的miRNA-基因?qū)捌湓贑AD中的靶基因。然后利用HUVECs細(xì)胞系，對(duì)miR-376a-3p-NRIP1的表型下游調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了分析與驗(yàn)證。
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