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一、研究背景

  阿爾茨海默病(AD)是一種與年齡及性別相關(guān)的腦部疾病。研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNAs)在腦部發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和腦部病理中起到重要的調(diào)節(jié)作用。因此，鑒定年齡及性別相關(guān)lncRNA在AD患者腦中的差異表達(dá)不僅可以為進(jìn)一步的機(jī)制研究提供靶點(diǎn)，還可以為AD患者的個(gè)體化治療提供理論基礎(chǔ)。

二、分析流程

1. limma包：矯正表達(dá)數(shù)據(jù)

2. GEO2R網(wǎng)頁(yè)工具：差異分析

3. KEGG富集分析：網(wǎng)頁(yè)工具(R2 KEGG pathway: http://r2.amc.nl)

4. 其余：GraphPad Prism

下面給大家推薦2個(gè)網(wǎng)頁(yè)工具，也可以代替上面的R包或GraphPad Prism進(jìn)行分析：

IDE.91

(http://bioinformatics.sdstate.edu/idep/)

矯正表達(dá)數(shù)據(jù)和差異分析

易漢博

(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/index.html)

可視化的一大利器

三、結(jié)果解讀

1.衰老大腦和AD患者大腦的lncRNA表達(dá)模式

• 分析正常年輕大腦（≤40歲）和衰老大腦（≥80歲）前額葉皮質(zhì)的lncRNA表達(dá)差異：衰老大腦中22個(gè)lncRNA表達(dá)上調(diào)，22個(gè)lncRNA表達(dá)下調(diào)。

• 分析正常大腦和AD患者大腦的lncRNA表達(dá)差異：AD患者大腦中18個(gè)lncRNA表達(dá)上調(diào)，32個(gè)lncRNA表達(dá)下調(diào)。

• 正常衰老大腦和AD患者大腦中有15個(gè)表達(dá)發(fā)生變化的lncRNA重合。

• 重合的15個(gè)lncRNA在衰老大腦和AD患者大腦中表達(dá)改變模式相同，且LINC01094，NEAT1和LINC00844表達(dá)顯著上調(diào)(Log FC>1)，LINC01007，LINC00507和OIP5-AS1表達(dá)顯著下調(diào)(Log FC<-1)。（如圖1）

2.AD患者大腦中異常表達(dá)的年齡相關(guān)lncRNA

• 對(duì)年齡和lncRNA log2表達(dá)量進(jìn)行Pearson相關(guān)分析：23個(gè)lncRNA表達(dá)量與年齡呈負(fù)相關(guān)，29個(gè)lncRNA表達(dá)量與年齡呈正相關(guān)（|r|>0.5,p<0.05）。

• 對(duì)正常大腦和(nd)和AD患者大腦lncRNA的平均log2表達(dá)值與年齡進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，同時(shí)提供95%的預(yù)測(cè)區(qū)間：在nd中與年齡顯著相關(guān)的16個(gè)lncRNA(|r|>0.75,p<0.05)在AD腦部表達(dá)發(fā)生異常改變。

  如年齡正相關(guān)lncRNA LINC00844，PRR34-AS1在AD中表達(dá)異常上調(diào)，年齡負(fù)相關(guān)lncRNAMIR7-3HG，LINC00643在AD中表達(dá)異常下調(diào)。（如圖2）

3.AD患者大腦中異常調(diào)節(jié)的性別相關(guān)lncRNA

• 分析GSE48350數(shù)據(jù)集的nd和AD樣本（如圖3A）：正常性別差異lncRNA中，有3個(gè)lncRNA在女性AD中差異表達(dá)，11個(gè)lncRNA在男性AD中差異表達(dá)；患者性別差異lncRNA中，有3個(gè)lncRNA在女性nd中差異表達(dá)，14個(gè)lncRNA在男性nd中差異表達(dá)。

• 與nd相比，13個(gè)性別相關(guān)lncRNA在男性和女性AD中表達(dá)均發(fā)生了改變（黑點(diǎn)為男性，灰點(diǎn)為女性）。

  雙向ANOVA分析（性別和AD兩個(gè)變量）發(fā)現(xiàn)性別因素在SLC25A25-AS1和RP11-45P15.4的表達(dá)中起重要作用，表明AD對(duì)性別相關(guān)lncRNA表達(dá)的影響依性別不同而不同。（圖3B、E）

• 用CPC和CPAT分析lncRNA的編碼潛能，發(fā)現(xiàn)AD中表達(dá)異常的這16個(gè)年齡相關(guān)lncRNA和13個(gè)性別相關(guān)lncRNA均不編碼RNA。

4.年齡及性別相關(guān)lncRNA與AD Braak分期及宿主基因的相關(guān)性

• 對(duì)GSE48350數(shù)據(jù)集的lncRNA log2平均表達(dá)值和Braak分期進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，研究lncRNA表達(dá)與疾病分期的關(guān)系：年齡相關(guān)lncRNA LINC00672與Braak分期負(fù)相關(guān)，年齡相關(guān)lncRNA SNHG19與Braak分期正相關(guān)；性別相關(guān)lncRNA RNF144A-AS1，LY86-AS1和LINC00639）與Braak分期負(fù)相關(guān)。

• 研究lncRNA表達(dá)是否與AD的重要組織病理缺損之一——神經(jīng)炎性斑塊（NP）密度有關(guān)，計(jì)算年齡及性別相關(guān)lncRNA log2表達(dá)量和平均NP密度的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)有4個(gè)lncRNA（RP11-223I10.1，LINC01094，OIP5-AS1和LINC01007）與平均NP密度呈中等程度線性相關(guān)(|r|>0.3,p<0.05,n=102)。

5.AD患者神經(jīng)元中的年齡及性別相關(guān)lncRNA的調(diào)節(jié)異常

• 用含AD患者和正常人額上回神經(jīng)元基因表達(dá)譜的GSE5281數(shù)據(jù)集，檢測(cè)lncRNA是否是神經(jīng)元特異性：發(fā)現(xiàn)大多數(shù)lncRNA在nd和AD患者中的表達(dá)改變模式相同。

• 年齡負(fù)相關(guān)lncRNA LY86-AS1，RP11-219A15.5，MIR7-3HG，LINC01007和LINC00643在AD患者神經(jīng)元中顯著下調(diào)；年齡正相關(guān)lncRNA NEAT1，PRR34-AS1和lnc-BLID-2在AD患者神經(jīng)元中顯著上調(diào)。

• 年齡負(fù)相關(guān)lncRNA OIP5-AS1在AD患者神經(jīng)元中顯著上調(diào)，表明OIP5-AS1在不同的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中改變模式不同，如在AD神經(jīng)元中上調(diào)，在AD神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中下調(diào)。

• AD相關(guān)lncRNA反映可以反映AD早期的氧化損傷和DNA損傷修復(fù)(DDR)水平。用GSE66333數(shù)據(jù)集評(píng)估AD相關(guān)lncRNA表達(dá)與DDR強(qiáng)度的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，AD早期的高水平氧化應(yīng)激和神經(jīng)元DDR可以誘發(fā)AD相關(guān)lncRNA的下調(diào)。

6.年齡及性別相關(guān)lncRNA的功能分析

• 用R2 KEGG pathway finder對(duì)lncRNA相關(guān)基因進(jìn)行通路富集分析，研究lncRNA在AD大腦中的潛在功能并列舉出前30個(gè)顯著富集的通路。（圖4）

• 年齡及性別相關(guān)lncRNA相關(guān)基因在AD，HD，PD等神經(jīng)退行性疾病中均顯著富集。

• AD的性別及年齡相關(guān)基因均在胞吞和前列腺癌通路中顯著富集。

• 正常大腦的lncRNA相關(guān)基因在蛋白酶體和長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)KEGG通路中均富集。