今天要給大家拆解的文獻是今年5月剛剛發(fā)表在Aging上的文章，影響因子5.515。文章題目是Identification and validation of hub microRNAs dysregulated in esophageal squamous cellcarcinoma。從標題很容易看出本研究是常規(guī)的hub基因研究，但本研究之所以能發(fā)表在5分 上，我覺得一是文章研究的是microRNAs，有所新意；二是文章還做了點簡單的實驗對篩選出的兩條microRNA進行了表型驗證。
數(shù)據(jù)解構(gòu)
挑——差異表達miRNA篩選
本文首先通過GEO數(shù)據(jù)庫篩選食管癌差異表達microRNAs（miRNAs）。作者選用了GSE114110和GSE43732兩個數(shù)據(jù)集進行分析。值得一提的是，作者還利用R語言的limma包對數(shù)據(jù)集進行了標準化處理。作者設定的閾值為|log2FC|≥ 1和P < 0.05，由圖E和F的火山圖可以看出篩選出的差異表達miRNAs相比于平時我們篩選mRNA時是要相對少一些的。作者使用的是limma包進行的差異表達分析，使用GEO數(shù)據(jù)庫的在線工具GEO2R也能達到同樣的目的。篩選到差異基因后，作者使用R語言VennDiagram包制作韋恩圖，使用網(wǎng)站Draw Venn Diagrams （http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）也可做出類似的圖。最終篩選得到3個上調(diào)的和5個下調(diào)的miRNAs。
此外再提一句，在分析多個數(shù)據(jù)集時，可以將多個數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)合并分析，但是必須得先去掉批次效應。如果不想去進行去批次的操作，可以像這篇文章這樣采用取交集的方式，這樣也算是有一定道理的。
聯(lián)——miRNA靶基因預測
miRTarBase（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）是一個經(jīng)過實驗驗證的miRNA-靶基因相互作用數(shù)據(jù)庫，作者利用這個數(shù)據(jù)庫對8個差異表達的miRNA的靶基因進行了預測。3個上調(diào)的和5個下調(diào)的hub miRNAs總共分別預測出468和753個可能的靶基因。
除了miRTarBase網(wǎng)站外，常用的miRNA靶基因預測網(wǎng)站還有Targetscan、ENCORI、miRDB、miRWalk等。
圈——miRNA靶基因GO和KEGG富集分析
聯(lián)——PPI網(wǎng)絡分析得到hub基因，miRNA-hub基因互作網(wǎng)絡構(gòu)建
作者又使用STRING數(shù)據(jù)庫對預測出468和753個可能的靶基因分別作了蛋白蛋白互作（PPI）分析，并進一步地利用Cytoscape軟件篩選得到hub基因各10個。然后對這20個基因做了GO和KEGG富集分析。本文作者將GO分析的三大類：生物過程（BP）、分子功能（MF）、細胞組分（CC）分開展示，并對靶基因、hub基因分別做富集分析，因此得到的圖比較多。
隨后，作者利用Cytoscape軟件構(gòu)建miRNA-hub基因網(wǎng)絡。由于miR-196a-5p和miR-1-3p所關聯(lián)的hub基因最多，作者進一步地利用miRNACancerMAP數(shù)據(jù)庫分析了miR-196a-5p和miR-1-3p所涉及的信號通路。
miRNACancerMAP（http://cis.hku.hk/miRNACancerMAP/）是一個可以預測、構(gòu)建癌癥miRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡的在線工具，只需點擊網(wǎng)站上方的Quick Search，輸入想要研究的miRNA，即可得到分析結(jié)果。
靠——miRNAs預后價值分析
隨后，作者利用利用TCGA數(shù)據(jù)庫、細胞系以及臨床樣本驗證了miR-196a-5p和 miR-1-3p的表達情況。并利用基于TCGA數(shù)據(jù)的starBase數(shù)據(jù)庫對miR-196a-5p和miR-1-3p進行Kaplan-Meier生存分析，以評估其預后價值。
干濕結(jié)合
到這里其實這篇文章已經(jīng)可以發(fā)表了，但最新的Aging已經(jīng)不收純生信文章了，要發(fā)5分必須補濕實驗。
干濕結(jié)合的參考組合有：
1、生信 臨床標本驗證
2、生信 功能表型驗證（細胞或者細胞 動物均可）
3、生信 臨床 功能表型驗證
4、生信 臨床 功能 機制研究
這篇文章運用的是“生信 臨床 功能表型驗證”組合，作者做了一點實驗來驗證miR-196a-5p和miR-1-3p對食管癌細胞增殖和遷移的影響。所用實驗為CCK-8、EdU和Transwell等常規(guī)實驗技術，比較簡單。這里作者只是用了miRNAmimics做實驗，其實還可增加使用miRNA inhibitors的實驗。
總結(jié)
到此全文就結(jié)束了，總結(jié)一下，作者先用GEO數(shù)據(jù)庫篩選得到食管癌差異表達miRNAs（挑），然后利用篩選得到的8條miRNAs預測靶基因（聯(lián)），并對靶基因進行富集分析（圈）；進一步地在靶基因中篩選得到hub基因（聯(lián)），并篩出兩條與hub基因聯(lián)系最多的miRNAs（聯(lián)）；最后對這兩條miRNAs進行生存分析，來說明臨床意義（靠），其實本文還可增加臨床相關性分析，ROC曲線等分析進一步豐富內(nèi)容。此外，這篇文章還增加了一點濕實驗的內(nèi)容：利用細胞系和臨床樣本驗證兩條miRNA的表達情況（臨床標本驗證），并利用細胞實驗驗證其對食管癌細胞增殖遷移能力的影響（功能表型驗證）。
整體來說，全文基本全部按照“挑、圈、聯(lián)、靠”的生信套路來進行，所用技術以在線工具為主，適合初學者模仿。
最后再給大家歸納一下干濕結(jié)合研究套路模板（加粗的是本文所用的方法）：
干：
挑：差異表達分析篩選目的基因
圈：GO/KEGG富集分析、GSEA富集分析、WGCNA網(wǎng)絡分析、其他特殊分析（miRNA相關通路預測、免疫浸潤等等）
聯(lián)：蛋白蛋白互作（PPI）分析、miRNA交互作用、分子網(wǎng)絡構(gòu)建
靠：生存分析、臨床相關系分析、單因素/多因素分析、差異表達預后分析、ROC曲線
濕：
1、臨床標本驗證（包括細胞系和臨床樣本）
2、功能表型驗證（細胞或者細胞 動物均可）
3、臨床 功能表型驗證
4、臨床 功能 機制研究
如果對這篇文章感興趣，想進一步研究，小伙伴們可以通過回復“ Summer'獲取文章全文。
