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一、研究背景

阿爾茨海默?。ˋD）是最常見的神經(jīng)退行性疾病，以進(jìn)行性記憶喪失和認(rèn)知退化為特征。β-淀粉樣蛋白組成的細(xì)胞外淀粉樣斑塊沉積和tau蛋白組成的神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)（NFTs）是AD的主要病理變化。

基于纏結(jié)神經(jīng)元的位置和修飾，可以將AD分為6個(gè)階段，即Braak分期——I&II：過渡內(nèi)嗅區(qū)階段 (transentorhinal stages)，無臨床癥狀；III&IV：邊緣區(qū)階段(limbic stage)，為AD初始階段；V–VI：新皮層階段(neocortical stages)，為發(fā)育完全的AD。簡(jiǎn)易智力狀態(tài)檢查（MMSE）是一種篩選和檢測(cè)癡呆進(jìn)展的認(rèn)知測(cè)驗(yàn)，得分低于24分表明可能患有癡呆，非癡呆老年人得分通常在24分或以上。NFT評(píng)分系統(tǒng)是另一種相關(guān)的衡量標(biāo)準(zhǔn)，通常與Braak分期一致，NFT III期提示AD。

二、分析流程

三、結(jié)果解讀

1.識(shí)別基因共表達(dá)模塊

由于檢查全基因組表達(dá)數(shù)據(jù)的共同挑戰(zhàn)是管理批次效應(yīng)，因此有必要在無法進(jìn)行樣品完全相似處理的情況下，持續(xù)監(jiān)視批次效應(yīng)。通過R包limma的normalizeBetweenArrays()函數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，在篩選出75%的最高中值絕對(duì)偏差(MAD)的基因后，從GSE1297得到9974個(gè)基因用于WGCNA分析。為了確定GSE1297的樣本是否適合網(wǎng)絡(luò)分析，作者首先研究了樣本的親緣關(guān)系樹圖和臨床特征，用R包的hclust函數(shù)對(duì)樣本進(jìn)行聚類分析，如圖1A所示，所有的樣本都出現(xiàn)在聚類里，沒有異常值。為了確定軟閾值，作者選取1-20作為閾值進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析（圖1BC），當(dāng)閾值為6時(shí)（scale-free R2 =0.872），基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)為無標(biāo)度的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，具有完整的模塊特征。

然后作者用拓?fù)渲丿B矩陣（TOM）構(gòu)建平均連鎖層次聚類，并根據(jù)相異度（1-TOM）對(duì)共表達(dá)模塊進(jìn)行劃分，得到了16個(gè)功能模塊（圖2）。接下來，作者用MEs（module eigengenes）的eigengene相關(guān)性計(jì)算了16個(gè)模塊間的相互作用關(guān)系，并可視化為熱圖（圖3A），顏色越深代表模塊間連接度越大。結(jié)果表明，各個(gè)模塊的個(gè)性水平較高、模塊中基因表現(xiàn)出相對(duì)獨(dú)立性。

2.模塊和臨床特征的相關(guān)性

為了探究這些功能模塊是否與疾病狀態(tài)有關(guān)，作者研究了每個(gè)功能模塊與MMSE、BRAAK、NFT、死亡時(shí)間（PMI）、年齡等AD臨床特征的關(guān)系。分析發(fā)現(xiàn)，一些模塊與AD的疾病狀態(tài)高度相關(guān)（圖3B中的lightcyan，pink，salmon和blue模塊），且這16個(gè)模塊大致可以分為2組（圖3C）。從圖3B可以看出，與其他模塊相比，MEpink模塊與所有疾病狀態(tài)（NFT，BRAAK，MMSE）均顯著關(guān)聯(lián)，提示其在AD的發(fā)生發(fā)展中必不可少。因此，作者接下來聚焦于Mepink模塊。

MEs是通過主成分分析計(jì)算得到的主要關(guān)鍵成分，主成分分析將特定模塊的基因表現(xiàn)概括為單個(gè)特征表達(dá)譜。通過基因顯著性（GS）和模塊顯著性（MS）量化相關(guān)模塊的基因表現(xiàn)，得到pink模塊與BRAAK、NFT、MMSE的相關(guān)性（圖4ABC）。然后用Cytoscape可視化模塊pink的基因網(wǎng)絡(luò)（圖4D），得到6個(gè)hub基因（AACS、GRIK1、HOXB2、KCNF1、MYBL1、RAP1GAP2）。

GS：第i個(gè)基因型xi和樣本臨床特征T的Pearson相關(guān)性，GSi = |cor(xi , T)|。MS：模塊中所有基因的平均GS。kme衡量模塊中基因和ME間的相關(guān)性：kme(i) = |cor(x(i),ME(q))|，模塊中kme高的基因定義為模塊內(nèi)hub基因。

3.功能模塊基因的功能富集分析

相似表達(dá)模式的基因可能參與相同的生物學(xué)過程或生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)，因此作者用DAVID對(duì)pink模塊的基因進(jìn)行GO富集分析。結(jié)果表明（圖5），模塊中基因多數(shù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、PI3K信號(hào)通路調(diào)節(jié)和離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中富集。

4.hub基因的效能

作者在GSE28146驗(yàn)證集中用hub基因進(jìn)行樣本的層次聚類分析，發(fā)現(xiàn)這些基因可以區(qū)分嚴(yán)重和非嚴(yán)重的AD樣本（圖6A）。因此進(jìn)一步用ROC曲線分析hub基因?qū)D樣本的區(qū)分能力，pink模塊的hub基因AUC值大于0.7，說明hub基因區(qū)分AD樣本的特異性和靈敏度高。

5.GRIK1在AD皮質(zhì)和AD海馬區(qū)上調(diào)，并減短原代神經(jīng)元的樹突長(zhǎng)度

最后，作者用qRT-PCR和WB檢測(cè)了hub基因GRIK1在AD皮質(zhì)和AD海馬的表達(dá)水平。結(jié)果表明，與正常人相比，GRIK1的mRNA和蛋白水平在AD患者皮質(zhì)和海馬區(qū)表達(dá)升高。而Phalloidin染色結(jié)果顯示GRIK1 pCDNA3.1組的樹突長(zhǎng)度比對(duì)照組短（圖7）。這些數(shù)據(jù)共同說明，GRIK1在AD皮質(zhì)和海馬區(qū)表達(dá)上調(diào)，且縮短原代神經(jīng)元的樹突長(zhǎng)度。

FITC和Rhodamin等熒光物質(zhì)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可特異的與真核細(xì)胞的F-actin結(jié)合，從而顯示微絲骨架在細(xì)胞中的分布。