病原學(xué)診斷始終是感染性疾病診斷中最重要的環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷是臨床醫(yī)師根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)做出一系列鑒別診斷，然后針對這些進(jìn)行檢測，通常一項(xiàng)檢測只能對應(yīng)一種病原體，而宏基因組學(xué)第二代測序(metagenomics next generation sequencing,以下簡稱二代測序)技術(shù)檢測能覆蓋更廣范圍的病原體。本專家共識就二代測序的臨床應(yīng)用范圍、樣本采集、分析解讀和診斷效能等方面進(jìn)行證據(jù)總結(jié)和意見推薦。
證據(jù)強(qiáng)度：A為強(qiáng)烈推薦；B為推薦，但其他替代方案也可接受；C為推薦強(qiáng)度低，尋求替代方案；D為從不推薦。證據(jù)質(zhì)量：Ⅰ為證據(jù)來自隨機(jī)對照試驗(yàn)，Ⅱ?yàn)樽C據(jù)來自非隨機(jī)對照試驗(yàn)，Ⅲ為證據(jù)僅來自專家意見。
(一)背景及概述
推薦意見1：若懷疑細(xì)菌、真菌、DNA病毒、寄生蟲、不典型病原體感染且需進(jìn)行二代測序檢測時(shí)，建議采用DNA檢測；若懷疑RNA病毒感染時(shí)，則建議采用RNA檢測(A，Ⅱ)。
推薦意見2：對于臨床疑似感染的病重、病危或免疫抑制、免疫缺陷患者，建議在完善傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室及分子生物學(xué)檢測的同時(shí)，采集疑似感染部位的標(biāo)本進(jìn)行二代測序(B，Ⅱ)。
二代測序檢測能覆蓋較大范圍的病原體，病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲都能被同時(shí)檢測，不論臨床樣本培養(yǎng)成功與否，只要含有可檢測到的DNA或RNA即可[1,2,3,4,5,6]。從接收樣本至完成數(shù)據(jù)分析，二代測序的周轉(zhuǎn)時(shí)間根據(jù)測序技術(shù)、方法和生物信息學(xué)分析方法的不同而不同，已有報(bào)道為6 h至7 d不等(平均48 h)[7,8]。
二代測序在感染性疾病診斷領(lǐng)域中的優(yōu)勢在于其能檢測到其他傳統(tǒng)手段無法檢測到的病原體。因此，二代測序可能在應(yīng)用于臨床疑難雜癥或免疫抑制患者時(shí)有更大意義。另外，二代測序也被報(bào)道可用于"排除"檢測，即檢測陰性有助于排除感染性疾病的診斷，但前提條件是測序覆蓋度足夠高，能確保樣本中存在的病原微生物被檢測出來[1]。二代測序的其他潛在應(yīng)用還包括病原體的耐藥基因檢測、醫(yī)院感染控制的監(jiān)測，以及社區(qū)傳染性疾病暴發(fā)的監(jiān)測，但這些應(yīng)用通常需要極高的覆蓋深度[9]。
從傳統(tǒng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)向分子生物學(xué)診斷需要臨床醫(yī)師及臨床微生物學(xué)家的思維轉(zhuǎn)變。傳統(tǒng)的微生物學(xué)是建立在體外分離培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，而實(shí)際上許多環(huán)境中或人體的致病微生物難以被培養(yǎng)，或許只能通過二代測序才能被發(fā)現(xiàn)[4]。所以臨床醫(yī)師及臨床微生物學(xué)家很有必要熟悉這個(gè)新工具，知曉其優(yōu)勢和局限性。
目前，尚鮮見針對二代測序結(jié)果解讀的規(guī)范，包括序列數(shù)閾值，以及靈敏性、特異性評估的統(tǒng)一臨床標(biāo)準(zhǔn)等。就像所有其他新技術(shù)，在解釋數(shù)據(jù)和報(bào)告數(shù)據(jù)方面仍有很大的困難與挑戰(zhàn)[10]。如能進(jìn)一步規(guī)范二代測序在臨床感染性疾病中的應(yīng)用，就可給予臨床實(shí)踐非常重要的線索和信息，協(xié)助臨床診斷。
(二)二代測序的適用范圍
1．二代測序在臨床疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中的適用范圍
推薦意見3：對于懷疑中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性感染的患者，如有條件，推薦在抽取腦脊液時(shí)同步留取2 mL腦脊液標(biāo)本保存于-16～20 ℃冰箱。在完成常規(guī)生物化學(xué)檢查和培養(yǎng)之后，若3 d內(nèi)未獲得明確的病原學(xué)依據(jù)且經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療無效，推薦對留存的腦脊液標(biāo)本進(jìn)行二代測序檢測。若未留存標(biāo)本，可重新采集標(biāo)本(A，Ⅱ)。
推薦意見4:對于疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)病毒感染的患者，如有條件，推薦在抽取腦脊液時(shí)同步留取2 mL腦脊液標(biāo)本保存于-16～20 ℃冰箱。在傳統(tǒng)PCR分子檢測(包括多重探針分子PCR方法)后若未能獲得明確的病原學(xué)依據(jù)，推薦對留存的腦脊液標(biāo)本進(jìn)行二代測序檢測。若未留存標(biāo)本，可重新采集標(biāo)本(A，Ⅱ)。
推薦意見5：對于慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染及需要隨訪病原學(xué)證據(jù)的患者，可首選二代測序進(jìn)行檢測(A，Ⅱ)。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查包括以下一種或多種：發(fā)熱(體溫>38 ℃)、頭痛、腦膜刺激征、嘔吐、抽搐、局灶性神經(jīng)功能障礙、意識改變或嗜睡、腦脊液中白細(xì)胞數(shù)量增加、腦脊液中蛋白質(zhì)水平升高和(或)葡萄糖水平降低、腦成像顯示感染的改變。
目前，在常見病原體之外，二代測序在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中已成功檢測到多種新發(fā)及少見病原體，如羊布魯菌、星狀病毒、熱帶假絲酵母、狒狒巴拉姆希阿米巴等[8]。對于慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的患者，二代測序檢測罕見、少見病原體的能力可顯著提高患者病原學(xué)確診的概率。在一項(xiàng)針對結(jié)核性腦膜炎患者的隊(duì)列研究中，二代測序被證實(shí)可提高患者的病原體檢出率[11]。
對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染進(jìn)展的臨床動(dòng)態(tài)監(jiān)測，主要以臨床表現(xiàn)、腦脊液常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果和腦脊液培養(yǎng)為指導(dǎo)。在某些情況下的特異性免疫試驗(yàn)如隱球菌乳膠凝集試驗(yàn)，可間接監(jiān)測病原體的載量情況。由于二代測序可檢測病原體及其匹配的序列數(shù)，所以能直接并結(jié)合宿主內(nèi)標(biāo)背景值半定量地顯示病原菌載量的動(dòng)態(tài)變化[12]。
對于急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的患者，在完成常規(guī)生物化學(xué)檢查和培養(yǎng)之后，若仍未獲得明確的病原學(xué)依據(jù)，建議將二代測序作為二線首選檢測手段。對于疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)病毒感染的患者，在傳統(tǒng)PCR檢測后若未能獲得明確的病原學(xué)依據(jù)，建議將二代測序作為二線首選檢測手段。對于慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染及需要隨訪病原學(xué)證據(jù)的患者，可首選二代測序進(jìn)行檢測。
2．二代測序在臨床疑似血流感染中的適用范圍
推薦意見6：對于懷疑血流感染的患者，如有條件，推薦在抽取血培養(yǎng)標(biāo)本時(shí)同步留取2 mL血標(biāo)本，分離血漿后保存于-16～20 ℃冰箱，血培養(yǎng)3 d未報(bào)陽且經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療無效時(shí)，推薦對留存血標(biāo)本進(jìn)行二代測序檢測。若未留存標(biāo)本，可重新采集標(biāo)本(A，Ⅱ)。
推薦意見7：對于懷疑繼發(fā)性血流感染的患者，在原發(fā)感染灶的病原學(xué)檢測為陰性或因各種因素?zé)o法送檢合適標(biāo)本的情況下，可考慮將血標(biāo)本的二代測序檢測作為二線檢測方法(B，Ⅲ)。
血流感染包括各種病原微生物(包括細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等)入侵血流所引起的感染。除單純性血流感染外，血流感染還包括感染性心內(nèi)膜炎、導(dǎo)管相關(guān)性血流感染等復(fù)雜性感染。血流感染可為原發(fā)性，亦可繼發(fā)于局灶性感染。應(yīng)注意的是，只要患者具有器官功能障礙且合并任何類型的感染均可診斷為膿毒癥，因而膿毒癥患者并不一定存在血流感染。血流感染的典型癥狀主要為畏寒、寒戰(zhàn)、發(fā)熱和毒血癥的癥狀，此外尚包括原發(fā)感染灶及遷徙性感染灶的臨床表現(xiàn)。部分血流感染患者還具有某些危險(xiǎn)因素，包括近期的有創(chuàng)操作史、血管內(nèi)植入物和吸毒史等。血流感染患者常有外周血白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)異常、CRP及ESR升高等實(shí)驗(yàn)室檢查異?，F(xiàn)象，但此類異常缺乏特異性。細(xì)菌性血流感染患者還常有降鈣素原水平顯著升高的現(xiàn)象。
血流感染的非選擇性二代測序檢測范圍涵蓋細(xì)菌、真菌、病毒(鼻病毒、腺病毒、CMV等)、不典型病原體(柯克斯體、巴爾通體等)。由于大部分血流感染的病原體[包括細(xì)菌、真菌、寄生蟲(如瘧原蟲)、部分病毒(如皰疹病毒)]均以DNA作為遺傳物質(zhì)，所以推薦將DNA二代測序作為血流感染的首選檢測方法，僅在不能排除RNA病毒感染(如腎綜合征出血熱、登革熱、病毒性肺炎等)時(shí)推薦進(jìn)行RNA測序[13]。
目前，由于缺乏抗感染治療對二代測序診斷性能影響的高等級研究，所以在血流感染中二代測序檢測的最佳時(shí)間窗仍未確定。研究提示，二代測序在患者起病后1～2周的時(shí)間內(nèi)仍可保持高于培養(yǎng)的陽性率，但其仍可隨時(shí)間推移下降[13]。此外，血培養(yǎng)與血二代測序存在優(yōu)勢互補(bǔ)的情況。故目前推薦在患者起病后盡快進(jìn)行二代測序檢測，如有條件，可在采取血培養(yǎng)標(biāo)本的同時(shí)留取血液標(biāo)本保存于-16～20 ℃環(huán)境，以備后續(xù)的二代測序檢測。在已經(jīng)接受治療的患者中進(jìn)行血二代測序作為補(bǔ)充檢測仍有較大價(jià)值。
3．二代測序在臨床疑似局灶性感染中的適用范圍
推薦意見8：對于懷疑局灶性感染的患者，在對局灶部位完成常規(guī)的生物化學(xué)、培養(yǎng)或PCR檢測后，若未能獲取病原學(xué)診斷結(jié)果，推薦將二代測序作為二線首選檢測手段(B，Ⅱ)。
局灶性感染是除血流感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、呼吸道感染外，以局部組織出現(xiàn)感染性癥狀如紅、腫、熱、痛、捫及波動(dòng)感、有膿液滲出為表現(xiàn)的一類疾病。部分局灶性感染可通過輔助檢查手段，如超聲檢查、影像學(xué)檢查、侵襲性檢查(內(nèi)鏡、穿刺等)，發(fā)現(xiàn)疑似感染性病灶(組織或積液)，伴或不伴炎癥相關(guān)指標(biāo)升高等[14]。
局灶性感染的主要特點(diǎn)為臨床表現(xiàn)多樣，可伴有不典型的臨床癥狀如疲勞、體質(zhì)量減輕、胃腸道癥狀等。特定感染可有其特征性的臨床表現(xiàn)，如皮膚軟組織感染可表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛，嚴(yán)重者可見膿液滲出；關(guān)節(jié)腔感染可表現(xiàn)為局部疼痛、腫脹，關(guān)節(jié)腔內(nèi)積聚大量漿液性、纖維素性或膿性滲出液，關(guān)節(jié)囊膨脹、按壓有波動(dòng)感、運(yùn)動(dòng)障礙等；尿路感染可有較為明顯的尿路刺激癥狀；眼部感染可表現(xiàn)為不同程度的疼痛、畏光、流淚、視力下降、眼瞼痙攣，結(jié)膜水腫、充血，結(jié)膜囊的黃色分泌物增多、玻璃體混濁等。嚴(yán)重者或伴全身毒血癥的癥狀，如發(fā)熱、寒戰(zhàn)，甚至休克等。
目前，已有多項(xiàng)研究報(bào)道二代測序可提高皮膚軟組織感染、骨關(guān)節(jié)感染、眼內(nèi)感染、尿路感染、漿膜腔感染、其他組織感染中的病原學(xué)檢測能力[15,16,17]，二代測序在局灶性感染標(biāo)本中的較高靈敏性可能與局灶性感染標(biāo)本中的致病病原體相對載量較高有關(guān)。在組織感染方面，對創(chuàng)傷弧菌、非結(jié)核分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌等均有較強(qiáng)的診斷價(jià)值[18,19]。在眼部感染中，除了對常見的病毒、細(xì)菌、真菌性眼內(nèi)炎有診斷價(jià)值以外，還對不常見的病原體如弓形蟲、棘阿米巴、風(fēng)疹病毒、隱球菌等感染有較強(qiáng)的提示作用[20,21,22]。在尿路感染中，研究顯示其可用于耐藥細(xì)菌的檢測[23]。
4．二代測序在臨床疑似呼吸道感染中的適用范圍
推薦意見9：對于呼吸道感染患者，若3 d內(nèi)未通過傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢查獲得明確的病原學(xué)依據(jù)且經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療無效，推薦留取呼吸道標(biāo)本進(jìn)行二代測序檢測(A，Ⅱ)。
推薦意見10：對于高度懷疑病毒性肺炎且病情持續(xù)進(jìn)展的患者，可先完善呼吸道病毒多重PCR檢測，若為陰性，再行二代測序檢測，并應(yīng)同時(shí)進(jìn)行核酸RNA反轉(zhuǎn)錄(A，Ⅱ)。
臨床上當(dāng)患者出現(xiàn)典型的呼吸道感染癥狀：上呼吸道癥狀，如鼻塞、流淚、流涕等鼻咽部卡他癥狀，以及咽痛等；下呼吸道癥狀，如咳嗽、發(fā)熱、咳痰、氣急、哮鳴、胸部不適、胸痛、咯血等；全身癥狀，如畏寒、發(fā)熱、寒戰(zhàn)等；體征上存在氧飽和度下降、呼吸急促、發(fā)紺、咽部黏膜紅腫、口腔皰疹、潰瘍、扁桃體腫大、有肺實(shí)變體征或聽診發(fā)現(xiàn)雙肺有干濕啰音等；實(shí)驗(yàn)室檢查見血白細(xì)胞計(jì)數(shù)偏高、炎性因子偏高；影像學(xué)檢查見肺部炎癥表現(xiàn)。在排除其他疾病后，均需考慮呼吸道感染。當(dāng)免疫抑制人群或住院患者出現(xiàn)相關(guān)癥狀時(shí)，更需考慮呼吸道感染，尤其是肺部感染的可能。當(dāng)有肺部慢性疾病如慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、支氣管擴(kuò)張的患者出現(xiàn)病情急性加重時(shí)，也應(yīng)考慮是否存在感染誘發(fā)因素。
根據(jù)二代測序原理，可對包括呼吸道定植菌群和引起感染的病原菌同時(shí)進(jìn)行檢測?？稍?4～72 h內(nèi)鑒定標(biāo)本中可能存在的常規(guī)方法無法鑒定的罕見病原體、病毒等。并可對多重感染進(jìn)行鑒定[1,24]。
目前，二代測序成本仍較高，商業(yè)化的二代測序檢測產(chǎn)品基于成本的考慮，其相對固定的數(shù)據(jù)覆蓋度(如20 M特異性序列)對不同類型呼吸道臨床樣本的靈敏度低于熒光PCR等傳統(tǒng)分子檢測方法。因此，其不能替代傳統(tǒng)檢測方法(除非加大測序覆蓋度使其靈敏度大于傳統(tǒng)分子檢測方法)，而是應(yīng)作為傳統(tǒng)方法無法明確感染病原體時(shí)的補(bǔ)充。對于普通呼吸道感染，先完善傳統(tǒng)方法的檢測；若無法明確且患者病情遷延不愈時(shí)，可將二代測序作為首選檢測手段。對于高度懷疑病毒性肺炎的患者，如在病毒高發(fā)季節(jié)急性起病、血白細(xì)胞計(jì)數(shù)正?；蚱?、病情進(jìn)展快，可先完善呼吸道病毒多重PCR檢測以及培養(yǎng)等；若為陰性，再行二代測序檢測，并應(yīng)同時(shí)進(jìn)行核酸RNA反轉(zhuǎn)錄。對于免疫抑制患者出現(xiàn)呼吸道感染或病情危重，在送檢傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法的同時(shí)，應(yīng)盡快行呼吸道標(biāo)本(盡量靠近病灶)二代測序檢測，以盡早明確罕見病原體或混合感染。
推薦意見11：采集樣本送檢二代測序必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則(A，Ⅱ)。
推薦意見12：樣本應(yīng)直接從患者感染部位的體液或組織中進(jìn)行采集(A，Ⅱ)。
推薦意見13：當(dāng)患者存在感染表現(xiàn)但病情危重或不能耐受有創(chuàng)操作時(shí)，可考慮采集患者的血液標(biāo)本送檢(B，Ⅱ)。
推薦意見14：實(shí)驗(yàn)室在充分保障生物安全性的前提下，應(yīng)建立完整的核酸檢測流程(樣本采集，樣本前處理/核酸抽提及文庫建立，質(zhì)量控制及生物信息分析，二代測序結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室判讀)(A，Ⅲ)。
推薦意見15：每批次實(shí)驗(yàn)中都應(yīng)包括內(nèi)參照、陰性對照品和陽性對照品。每批次實(shí)驗(yàn)均需嚴(yán)格評估是否存在操作或環(huán)境帶來的污染。單個(gè)樣本測序數(shù)據(jù)量特異性序列片段數(shù)建議不低于2×107條(即20 M特異性序列數(shù))，此外建議測序序列讀長不少于單端50 bp(A，Ⅲ)。
推薦意見16：對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)，建議采用臨床應(yīng)用級別的數(shù)據(jù)庫，審慎使用公共數(shù)據(jù)庫(A，Ⅲ)。
推薦意見17：建議二代測序檢測病原體的報(bào)告應(yīng)涵蓋該批次實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)參照、陰性對照品和陽性對照品結(jié)果，并記錄相關(guān)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，如單個(gè)樣本數(shù)據(jù)量、序列讀長，以及相關(guān)的質(zhì)控參數(shù)(A，Ⅲ)。
(一)樣本采集
針對患者感染部位的不同，采集的樣本類型主要包括靜脈血、腦脊液、痰液、肺泡灌洗液、胸腔積液、腹水、組織、咽拭子、局灶穿刺物等多種類型。不同類型的樣本采集需遵循以下原則：①對于無菌體液，如靜脈血、腦脊液、胸腔積液、腹水等，需按照嚴(yán)格的無菌操作采集樣本，采集前對局部或周圍皮膚進(jìn)行消毒處理，消毒液需與皮膚作用一定時(shí)間，待皮膚干燥后再取樣，一般收集第2管標(biāo)本送檢。采集的樣本須置于無菌容器內(nèi)。②對于有菌部位的樣本，如痰液、肺泡灌洗液、咽拭子等，應(yīng)標(biāo)明樣本的采集部位，在樣本采集過程中應(yīng)盡量避免引入該部位的正常菌群，以免干擾后續(xù)檢測結(jié)果。
采集的樣本應(yīng)盡量選取感染部位的體液或組織，可提高檢測結(jié)果的可信度。若感染部位的樣本采集難度較大，可選擇外周血液標(biāo)本，但有可能會降低檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[25]。
所有采集的感染部位樣本均應(yīng)及時(shí)送檢。標(biāo)本遠(yuǎn)距離運(yùn)輸需采用冷鏈運(yùn)輸，并保證無菌原則。應(yīng)嚴(yán)格遵守相應(yīng)測序廠商的運(yùn)輸標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序(standard operation procedure，SOP)，盡可能避免凍融環(huán)節(jié)。對于不能及時(shí)送檢的樣本，應(yīng)按照前述各個(gè)標(biāo)本的相應(yīng)要求進(jìn)行保存[26]。
(二)樣本前處理/核酸抽提及文庫建立
不同樣本類型均來源于疑似感染部位，具有潛在的感染性，在樣本處理前需進(jìn)行滅活處理。對于痰液樣本，由于本身黏性較高，為方便后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作，滅活后還需進(jìn)行液化處理；對于血液樣本，需根據(jù)實(shí)際檢測需求決定是否離心進(jìn)行血漿分離；對于組織樣本，為提高核酸提取效率，需預(yù)先將其切碎后進(jìn)行操作。
所有的檢測樣本均來自人體的不同部位，因此在樣本中本身就包含了大量人源細(xì)胞(或人源基因組/轉(zhuǎn)錄組成分)，而且不同類型的樣本中人源細(xì)胞(或人源基因組/轉(zhuǎn)錄組成分)含量也不一致，為提高檢測結(jié)果的靈敏性，在不影響樣本中病原體含量的前提下，可通過差異離心法或過濾等選擇性地去除部分人源細(xì)胞(或人源基因組/轉(zhuǎn)錄組成分)。
不同部位的樣本經(jīng)過處理后都要進(jìn)行核酸提取，核酸的質(zhì)量是決定二代測序成功的關(guān)鍵，因此不同實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立完整的核酸檢測流程，通過測定核酸的完整性或降解程度，制訂合格樣本的標(biāo)準(zhǔn)。此外，文庫制備流程對核酸樣本有嚴(yán)格要求，需對每次提取的核酸樣本進(jìn)行定量檢測，以確保核酸量滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。針對不同樣本類型對提取的核酸進(jìn)行文庫制備，文庫制備流程一般包括核酸片段化、末端修復(fù)、標(biāo)簽接頭連接和PCR文庫等。
提取試劑盒及全流程中各種試劑的選擇，都應(yīng)考慮生產(chǎn)過程中的工程菌和環(huán)境污染微生物的核酸殘留信息，以及對檢測所造成的影響。在操作過程中應(yīng)嚴(yán)格采取無菌流程，污染防控對標(biāo)本結(jié)果的質(zhì)量控制至關(guān)重要。每批次實(shí)驗(yàn)中都應(yīng)包括內(nèi)參照、陰性對照品和陽性對照品，以評估每批次樣本中是否存在操作或環(huán)境帶來的污染以及檢測流程是否存在異常。
(三)質(zhì)量控制及生物信息分析
質(zhì)量控制體系應(yīng)包含多個(gè)質(zhì)量控制點(diǎn)，依次為樣本運(yùn)輸溫控、提取濃度與純度、出庫濃度、文庫片段分布、下機(jī)總數(shù)據(jù)量、測序質(zhì)量(Q20、Q30比率)等，分別監(jiān)控運(yùn)輸溫度、核酸提取、文庫構(gòu)建、下機(jī)數(shù)據(jù)可靠性等方面，任何不符合質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的檢測都應(yīng)及時(shí)終止，重新檢測，或在無法重新檢測的情況下可提供預(yù)警，以供臨床參考。
全流程的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包含但不限于如下幾項(xiàng)：①每批次實(shí)驗(yàn)中都應(yīng)包括內(nèi)參照、陰性對照品和陽性對照品。②在缺乏有效的人源宿主去除步驟的情況下，建議單個(gè)標(biāo)本測序數(shù)據(jù)量特異性序列片段數(shù)不低于2×107條(即20 M特異性序列數(shù))。③為確保序列比對的準(zhǔn)確性，避免因同源錯(cuò)配導(dǎo)致的序列比對錯(cuò)誤，建議測序序列單端讀長不少于50 bp。目前，國際上采用的二代測序儀也可進(jìn)行雙端測序，但雙端測序所花費(fèi)的經(jīng)濟(jì)成本及時(shí)間均高于單端測序，所以不在臨床標(biāo)本感染病原體檢測中作為首要推薦。推薦采用臨床應(yīng)用級別的數(shù)據(jù)庫，對臨床病原體的不同種、不同型別有滿足需求的區(qū)分度。生物信息分析流程應(yīng)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，以自動(dòng)化為主，以人工糾錯(cuò)為輔，不應(yīng)帶有過多的人工判讀成分。建議二代測序檢測報(bào)告應(yīng)涵蓋該批次實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)參照、陰性對照品和陽性對照品結(jié)果，并記錄相關(guān)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，如測序質(zhì)量、單個(gè)樣本數(shù)據(jù)量、序列讀長、檢出病原微生物序列數(shù)、相對豐度等。
(四)二代測序結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室判讀推薦
目前，不同的測序平臺其二代測序病原體檢測的判讀閾值可能不同，但是應(yīng)建議將下列標(biāo)準(zhǔn)用于所有二代測序病原體檢測流程。滿足"(三)質(zhì)量控制及生物信息分析"中質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的下機(jī)數(shù)據(jù)，在進(jìn)入分析解讀流程后應(yīng)遵循以下原則：①剔除試劑、環(huán)境、測序和生物信息分析流程中引入的假陽性病原體信息，將樣本中含有的病原體核酸信息真實(shí)地呈現(xiàn)給臨床。②原則上報(bào)告病原體信息應(yīng)準(zhǔn)確到種(檢出序列數(shù)極少或極高相似度的病原體復(fù)合群除外)，同時(shí)應(yīng)包含相應(yīng)的屬信息。③建議根據(jù)病原體出現(xiàn)的頻度和臨床致病性等信息，將臨床高度關(guān)注、健康人樣本中極少出現(xiàn)的病原體核酸信息單獨(dú)呈現(xiàn)(即高度致病可能性)，同時(shí)將某些部位(如呼吸道、皮膚、腸道等)的常見、低(或無)致病性病原體(定植菌等)單獨(dú)呈現(xiàn)。④建議對報(bào)告中呈現(xiàn)的所有病原體引用權(quán)威文獻(xiàn)進(jìn)行關(guān)鍵信息的注釋，以便臨床能快速做出判斷。報(bào)告中應(yīng)有適度的微生物相關(guān)信息及相關(guān)文獻(xiàn)幫助臨床醫(yī)師理解報(bào)告結(jié)果。
已有的報(bào)道和研究均提示，二代測序?qū)Πㄖ袠猩窠?jīng)系統(tǒng)感染、血流感染和呼吸道感染在內(nèi)的各部位感染均有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。在某些臨床場景中，二代測序不僅有助于進(jìn)行快速、精準(zhǔn)的診斷，而且也對制訂抗感染治療方案及后續(xù)療效評估具有指導(dǎo)作用。2016年，美國食品與藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)發(fā)布了二代測序體外診斷產(chǎn)品的指南草案；2018年，二代測序被寫入《中國成人醫(yī)院獲得性肺炎與呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎診斷和治療指南(2018年版)》[27]；2019年，關(guān)于二代測序的《宏基因組分析和診斷技術(shù)在急危重癥感染應(yīng)用的專家共識》發(fā)布[25]。
推薦意見18：二代測序結(jié)果應(yīng)在與患者臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查密切結(jié)合的前提下進(jìn)行解讀和驗(yàn)證(B，Ⅲ)。
推薦意見19：對于疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血流、呼吸道感染或需排除感染性疾病的患者，根據(jù)推薦意見1至13采集合適的樣本進(jìn)行二代測序，根據(jù)送檢樣本類型結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)及其他結(jié)果輔助判斷或排除診斷，同時(shí)應(yīng)注意排除檢出病原體定植的情況(B，Ⅱ)。
2014年，有基于二代測序?qū)?例中樞神經(jīng)系統(tǒng)鉤端螺旋體感染病例進(jìn)行臨床診斷的報(bào)道[6]。隨后全球范圍內(nèi)陸續(xù)報(bào)道了通過對腦脊液及腦組織進(jìn)行二代測序檢測而確診的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病例，其病原譜包括病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲等[28,29,30]。一項(xiàng)前瞻性研究納入10例中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)炎癥患者，對其腦組織進(jìn)行二代測序檢測，除了協(xié)助3例明確病原學(xué)診斷外，還提示二代測序陰性結(jié)果有助于排除感染性疾病的診斷[31]。另一項(xiàng)系統(tǒng)綜述通過檢索25篇論文共對44例以二代測序?yàn)樵\斷方法的疑似腦炎患者進(jìn)行綜合分析，其中16例同時(shí)可通過PCR等方式確診，另外28例則為其他檢測方法難以明確診斷的新發(fā)或少見/罕見病原菌感染病例，提示二代測序可協(xié)助臨床疑難感染的診斷[8]。
還有一項(xiàng)研究以健康志愿者為陰性對照，對78例膿毒癥患者的血漿進(jìn)行二代測序檢測，檢出病毒陽性15例，細(xì)菌及真菌陽性17例；提示二代測序聯(lián)合血培養(yǎng)較單用血培養(yǎng)可顯著提高病原體的檢出率[32]。而對于呼吸道感染，相關(guān)研究主要集中在病毒所致感染。2015年，研究發(fā)現(xiàn)低覆蓋度(<1 M特異性序列數(shù))二代測序?qū)Ρ茄适米拥牟《緳z出率雖然低于反轉(zhuǎn)錄PCR，但其有助于確定病毒亞型和血清型，也說明了測序數(shù)據(jù)覆蓋度的重要性[33]。二代測序在縮短診斷周轉(zhuǎn)時(shí)間方面也具有一定優(yōu)勢[34]。我國一項(xiàng)對178例重癥肺炎患者的回顧性研究結(jié)果提示，二代測序可幫助進(jìn)行早期病原學(xué)診斷，指導(dǎo)抗菌藥物的應(yīng)用，從而降低患者的病死率[35]。
推薦意見20：對于二代測序結(jié)果為陰性，但根據(jù)其他輔助檢查結(jié)果(如培養(yǎng)結(jié)果)高度提示感染可能的尚不能排除感染的患者，建議必要時(shí)再次取樣重復(fù)二代測序檢測(B，Ⅱ)。
若二代測序結(jié)果符合患者的臨床表現(xiàn)和其他實(shí)驗(yàn)室檢查，推薦根據(jù)二代測序結(jié)果指導(dǎo)臨床決策。若患者二代測序結(jié)果陽性且符合臨床表現(xiàn)，但缺乏除二代測序結(jié)果外的其他實(shí)驗(yàn)室支持證據(jù)，應(yīng)進(jìn)行PCR驗(yàn)證(在具有合適引物的條件下)，并建議臨床進(jìn)一步完善可獲得的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢查加以驗(yàn)證。若患者二代測序結(jié)果陽性，但臨床表現(xiàn)或?qū)嶒?yàn)室檢查結(jié)果不支持該結(jié)果，則不能僅根據(jù)二代測序結(jié)果進(jìn)行診斷，而應(yīng)以傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果為首要臨床參考依據(jù)。對于二代測序結(jié)果為陰性，但根據(jù)其他輔助檢查結(jié)果(如培養(yǎng)結(jié)果)高度提示感染可能的尚不能排除感染的患者，建議必要時(shí)再次取樣重復(fù)二代測序檢測。
推薦意見21：在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中，目前證據(jù)提示二代測序檢測細(xì)菌、寄生蟲、病毒的效果較好，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)真菌感染仍需更大樣本量的臨床試驗(yàn)來檢驗(yàn)其檢測效能(B，Ⅱ)。
由于二代測序在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中的應(yīng)用仍以病例報(bào)道為主，所以可參考的大型研究較少。腦脊液通常含有較低的病原體量，故病原體檢測更具挑戰(zhàn)性。在5項(xiàng)關(guān)于腦脊液的二代測序研究中，診斷率分別為0(0/36)、1.6%(2/125)、6%(4/62)、19%(3/16)和30%(3/10)[36,37,38,39,40]，在無細(xì)胞的腦脊液上清液中只能檢測到無細(xì)胞病毒或無細(xì)胞微生物核酸，會導(dǎo)致較低的檢出率，提示臨床應(yīng)采用腦脊液而非上清液作為二代測序標(biāo)本[8]。
國外一項(xiàng)研究顯示，與傳統(tǒng)臨床實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果比較，二代測序的靈敏度為73%，特異度為99%，陽性預(yù)測值為81%，陰性預(yù)測值為99%[2]。另一項(xiàng)前瞻性研究對腦膜炎、腦炎和(或)脊髓炎患兒中收集到的20份腦脊液陽性樣本進(jìn)行二代測序檢測，與傳統(tǒng)的腦脊液微生物檢測相比，二代測序檢測診斷致病病原體的靈敏度為92%，特異度為96%[9]。我國患兒的腦脊液測序數(shù)據(jù)顯示，55.56%的二代測序檢測結(jié)果與臨床傳統(tǒng)方法學(xué)一致，其中主要的病原體為細(xì)菌[30]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的初治患者中，與培養(yǎng)相比，二代測序具有90%的靈敏度，其檢出率較培養(yǎng)提高了約25%[41]。已有的研究結(jié)果提示二代測序檢測細(xì)菌、寄生蟲、病毒的效果較好，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)真菌感染仍需更大樣本量的臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證其檢測效能。
推薦意見22：對于膿毒癥患者，推薦聯(lián)合采用傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和二代測序來提高病原學(xué)的檢出率(B，Ⅱ)。
血流感染的異質(zhì)性較大，目前尚缺乏針對血流感染者的大型二代測序診斷效能研究?，F(xiàn)有的研究結(jié)果提示，血液樣本二代測序與血培養(yǎng)保持了高度的一致性，是可靠的病原學(xué)檢測方法。一項(xiàng)中國的研究顯示，以培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，二代測序的靈敏度和特異度分別為72.7%和89.6%；此外，二代測序還表現(xiàn)出了比血培養(yǎng)更高的額外檢測效能，成為血培養(yǎng)的有力補(bǔ)充[32]。若以培養(yǎng)聯(lián)合二代測序、桑格法測序驗(yàn)證作為金標(biāo)準(zhǔn)，則二代測序的陽性率較單用血培養(yǎng)有顯著提升(23.08%比12.82%)[32]。另一項(xiàng)關(guān)于膿毒癥休克的研究中，二代測序的陽性率在起病前3周內(nèi)波動(dòng)于71%左右，而血培養(yǎng)陽性率僅在起病時(shí)達(dá)33%，此后波動(dòng)于10%～20%[42]。
推薦意見23：對于局灶膿腫或組織感染患者，二代測序的總體靈敏性和特異性均較好，其中對細(xì)菌檢測的靈敏性優(yōu)于真菌(A，Ⅱ)。
在關(guān)于局灶性感染的病原體檢測報(bào)道中，個(gè)案報(bào)道較多。但已有研究證實(shí)，二代測序在包括局灶膿液、感染部位組織、感染性的體液標(biāo)本中的靈敏性均優(yōu)于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測。在骨關(guān)節(jié)感染中，二代測序與臨床培養(yǎng)陽性標(biāo)本的一致率可達(dá)83%～94.8%，在培養(yǎng)陰性的標(biāo)本中可額外檢出49.3%～93%的病原體[43,44]。肺組織二代測序?qū)?xì)菌感染的靈敏度可達(dá)100%，特異度為76.5%；對真菌感染的靈敏度為57.1%，特異度為61.5%；對細(xì)菌和真菌的陽性預(yù)測值分別為42.9%和44.4%，陰性預(yù)測值分別為100%和72.7%[45]。
推薦意見24：對于呼吸道感染，二代測序在病毒及少見病原體的檢測中體現(xiàn)出較好的檢測效能；但在細(xì)菌、真菌等病原體的檢測中，二代測序尚不能準(zhǔn)確判斷菌群定植或感染狀態(tài)，仍需依賴臨床醫(yī)師結(jié)合患者病情進(jìn)行進(jìn)一步分析(A，Ⅱ)。
推薦意見25：對于結(jié)核分枝桿菌、傷寒沙門菌、布魯菌等胞內(nèi)菌，以及具有細(xì)胞壁的真菌，二代測序的檢測效能會相對降低，應(yīng)對上述菌群設(shè)置特定的序列數(shù)閾值(A，Ⅲ)。
在二代測序檢測呼吸道病原體的研究中，一項(xiàng)研究對67份兒科呼吸道感染患者的鼻咽拭子標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行了多重PCR和二代測序檢測，兩者的一致率為93%；二代測序漏診了其中3例，但多重PCR同樣未檢測到其中2例患者感染的病毒；同時(shí)，二代測序檢測到了PCR靶向范圍外的11株病毒[46]。在成人上呼吸道感染領(lǐng)域，一項(xiàng)研究探索了二代測序在89份成人急性上呼吸道感染鼻咽拭子標(biāo)本中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)二代測序的靈敏度為77.55%，特異度為80.49%～100.00%；在二代測序漏診的標(biāo)本中，相應(yīng)病原體的實(shí)時(shí)PCR循環(huán)閾值顯著更高，提示病原體載量低，在低數(shù)據(jù)量覆蓋度的情況下可能影響二代測序的檢出率[33]。另一項(xiàng)研究評估了二代測序在24份流行性感冒病毒陽性的呼吸道標(biāo)本(包括肺泡灌洗液、痰液和咽拭子)中的檢測性能；24份標(biāo)本中，18份的二代測序結(jié)果與PCR完全一致，另外6份不一致的標(biāo)本中，病毒實(shí)時(shí)PCR循環(huán)閾值均高于35[47]。還有研究將二代測序應(yīng)用于16例急性下呼吸道感染患者的鼻咽抽吸物標(biāo)本，其中15份標(biāo)本中都檢出了病毒，結(jié)果與PCR完全一致[48]。在重癥肺炎患者中，培養(yǎng)和二代測序的一致性達(dá)55.5%，且二代測序有更高的靈敏度[35]。綜上所述，目前已發(fā)表的關(guān)于二代測序應(yīng)用于臨床標(biāo)本的檢測效能研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)樣本中病原微生物含量較高時(shí)，二代測序的總體檢測效能與PCR差距不大；但當(dāng)病毒載量較低時(shí)，當(dāng)前二代測序(20 M左右特異性序列數(shù))會出現(xiàn)假陰性，在靈敏度方面不如PCR，需要通過進(jìn)一步增加數(shù)據(jù)量來提高檢測靈敏度。
二代測序可對不明、少見、不典型病原體進(jìn)行檢測。一項(xiàng)中國的研究對561例患者(其中呼吸道感染255例)的各種標(biāo)本行二代測序檢測(其中肺泡灌洗液＋痰標(biāo)本共292份)；結(jié)果提示與培養(yǎng)相比，二代測序?qū)Y(jié)核分枝桿菌、厭氧菌、真菌的檢出率均顯著高于培養(yǎng)；以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，二代測序比培養(yǎng)顯著提高了靈敏度(50.7%比35.2%)，而特異度無顯著區(qū)別[24]。另一項(xiàng)研究對13例診斷為社區(qū)獲得性肺炎的免疫抑制患者進(jìn)行二代測序檢測，結(jié)果二代測序和培養(yǎng)都檢測到5株陽性細(xì)菌；但是在真菌檢測方面，二代測序?qū)Ψ捂咦泳撵`敏度明顯高于培養(yǎng)[49]。在臨床應(yīng)用中，對于結(jié)核分枝桿菌、傷寒沙門菌、布魯菌等胞內(nèi)菌，以及具有細(xì)胞壁的真菌，二代測序的檢出效能會相對降低，應(yīng)對上述菌群設(shè)置特定的序列數(shù)閾值或結(jié)合捕獲技術(shù)以提高測序數(shù)據(jù)的覆蓋度[24,50]。
綜上，在呼吸道有菌環(huán)境下的二代測序結(jié)果的判讀尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。關(guān)于二代測序應(yīng)用于細(xì)菌、真菌檢驗(yàn)效能的研究尚不多。目前的數(shù)據(jù)提示與培養(yǎng)相比，二代測序能顯著提高靈敏度。但對于結(jié)核分枝桿菌等病原體，與臨床診斷相比，二代測序的診斷還需更多探索。
推薦意見26：對于新發(fā)、罕見、疑難感染性疾病，以及免疫缺陷患者，二代測序能顯著提高病原體的檢出率，可作為上述疾病的一線檢測手段(A，Ⅲ)。
雖然二代測序檢測成本高，但其在免疫缺陷患者和重癥患者的病原學(xué)診斷中體現(xiàn)出較高的臨床應(yīng)用價(jià)值[51]。在使用糖皮質(zhì)激素合并感染的人群中，二代測序指導(dǎo)下的抗感染治療方案的成功率為81.8%，顯著高于經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療的52.6%[52]。對于新發(fā)、罕見或疑難感染性疾病，更具有傳統(tǒng)培養(yǎng)及其他靶標(biāo)分子診斷技術(shù)所不具備的優(yōu)勢。如2015年報(bào)道的首例雜色松鼠1博爾納病毒(variegated squirrel Bornavirus-1，VSBV-1)所致的腦炎病例和2018年報(bào)道的首例人感染豬皰疹病毒眼內(nèi)炎病例[53,54]，二代測序均在診斷過程中起到了不可替代的作用。因此建議對于上述疾病，二代測序可作為一線檢測手段。
推薦意見27：目前，開展二代測序的成本仍較高，尚不能作為輕癥感染性疾病的一線檢測手段(A，Ⅲ)。
自2014年二代測序首次被用于臨床感染病例的病原學(xué)診斷以來，其正越來越廣泛地被應(yīng)用于臨床實(shí)踐。但目前二代測序檢測的成本仍顯著高于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測方法。在國內(nèi)，完成1次二代測序檢測的費(fèi)用仍較高；在美國，也需花費(fèi)上千美元。與之相比，完成1次血培養(yǎng)約40元人民幣，完成1次16 S PCR檢測則需約50元人民幣。高成本仍是制約二代測序在國內(nèi)廣泛開展的主要因素之一。
隨著技術(shù)的進(jìn)一步成熟，未來二代測序病原體檢測應(yīng)進(jìn)一步在成本下降、診斷標(biāo)準(zhǔn)完善、質(zhì)量控制提升等方面進(jìn)行完善。同時(shí)應(yīng)進(jìn)一步增加大樣本量的研究，以建立中國感染病原體宏基因組學(xué)檢測的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范。
編寫專家(按姓氏拼音排序)：曹清(上海兒童醫(yī)學(xué)中心感染科)、陳佰義(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科)、陳力(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚與性病科)、陳澍(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科)、胡必杰(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院感染科)、黃麗素(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院兒內(nèi)科)、黃文祥(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科)、黃燕(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院感染科)、李敏(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科)、連建奇(附屬唐都醫(yī)院感染科)、劉曉清(北京協(xié)和醫(yī)院感染科)、劉正印(北京協(xié)和醫(yī)院感染科)、羅艷萍(廈門市集美區(qū)婦幼保健院兒內(nèi)科)、馬小軍(北京協(xié)和醫(yī)院感染科)、馬筱玲(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科)、繆曉輝(上海長征醫(yī)院感染科)、王明貴(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所)、肖永紅(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院感染科)、臧國慶(上海市第六人民醫(yī)院感染科)、張文宏(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科)、張欣欣(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院感染科)、周惠娟(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院感染科)
執(zhí)筆秘書：艾靜文(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科)
