單細胞及微量樣本的DNA甲基化組學(xué)研究很大程度上受制于建庫測序技術(shù)。傳統(tǒng)的文庫構(gòu)建方法或類似于基因組DNA的單細胞擴增技術(shù)很難應(yīng)用到甲基化實驗過程中。易基因建立了基于線性擴增和單管建庫的技術(shù)，可充分降低文庫偏好性，準(zhǔn)確的完成珍貴樣本的全基因組甲基化研究。
單細胞及微量珍稀樣本的甲基化研究主要應(yīng)用于腫瘤發(fā)生機制，癌癥研究，胚胎植入前診斷，胚胎早期發(fā)育，生殖細胞重組，干細胞及細胞異質(zhì)性等研究領(lǐng)域。應(yīng)用的樣本包括單細胞、微量細胞等。
技術(shù)優(yōu)勢
1.超低起始量：單細胞或超低的建庫DNA起始量；
2. 測序覆蓋度高：最大限度地獲取完整的全基因組甲基化信息，精確繪制甲基化圖譜；
3. 單堿基分辨率：可精確分析每一個C堿基的甲基化狀態(tài)。
實驗策略
信息分析
技術(shù)參數(shù)
樣本要求：
細胞分離：由合作方完成單細胞分離
樣本要求：單個細胞，少量細胞等稀有樣本或者5 pg以上的基因組DNA
擴增技術(shù)：隨機引物擴增技術(shù)
測序深度：≥ 30x
項目周期：
15個樣本以下標(biāo)準(zhǔn)運轉(zhuǎn)周期約為33個工作日。由于不同的物種所需的數(shù)據(jù)量不同，所需的建庫數(shù)量差別很大，因此遇樣品數(shù)較多時，項目周期需要與技術(shù)支持人員確定。
研究案例
人類植入前胚胎發(fā)育的單細胞DNA甲基化組圖譜
Zhu, P., et al. (2018). "Single-cell DNA methylome sequencing of human preimplantation embryos." Nat Genet 50(1):
1、背景：
在哺乳動物基因組上，胞嘧啶（主要是CpG二連體中的胞嘧啶）在DNA甲基化酶的催化下會發(fā)生甲基化。研究顯示，DNA甲基化對多個生物學(xué)過程都至關(guān)重要，如基因表達抑制、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)、X染色體的失活，以及基因組印記的維持等。此前研究顯示在著床前的早期胚胎發(fā)育過程中只有大規(guī)模的DNA去甲基化。而此次研究數(shù)據(jù)顯示，精子和卵細胞結(jié)合受精之后，在人類早期胚胎大規(guī)模DNA去甲基化的同時，也在大量高度特異的DNA從頭加甲基化，這表明在人類早期胚胎第一輪DNA甲基化組重編程過程中，全局的DNA去甲基化'凈結(jié)果’實際上是高度有序的大規(guī)模DNA去甲基化和局部DNA加甲基化兩種分子過程相互拮抗產(chǎn)生的動態(tài)平衡的結(jié)果。
2、方法：
利用單細胞DNA甲基化組高通量測序方法，首次在單細胞分辨率對人類植入前胚胎發(fā)育過程進行了更加深入的分析。
3、結(jié)論：
在這篇文章中，為了進一步在單細胞水平研究DNA甲基化重編程過程的動態(tài)特征，利用單細胞全基因組DNA甲基化組高通量測序技術(shù)，對人類植入前胚胎發(fā)育的各個關(guān)鍵階段進行了單細胞、單堿基分辨率的系統(tǒng)研究，主要發(fā)現(xiàn)有： （1）首次發(fā)現(xiàn)了人類植入前胚胎發(fā)育過程中存在大量特異性的DNA從頭加甲基。（2）首次發(fā)現(xiàn)從二細胞胚胎階段開始父母本基因組上的剩余甲基化水平發(fā)生逆轉(zhuǎn)，在同一個單細胞中母本基因組上的剩余甲基化水平顯著高于父本基因組上的剩余甲基化水平。（3）首次發(fā)現(xiàn)DNA甲基化在早期胚胎卵裂過程中的不對稱分配可以用來追溯同一個胚胎中每個細胞的遺傳譜系。
原文解讀：
