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m6A是RNA上最豐富的一種修飾，平均每條轉錄本有1~3個m6A修飾。m6A甲基化通過基因轉錄后調(diào)控，參與細胞分化、胚胎發(fā)育、X染色體失活、環(huán)境應激和各種疾病的發(fā)生發(fā)展。本期以科研內(nèi)容為序，總結近期易基因RNA m6A甲基化合作研究成果，并就m6A RNA甲基化研究思路進行總結。
01 獼猴和小鼠模型麻醉影響精細運動能力損傷：MeRIP-seq + RIP + scRNA-seq
標題：Sevoflurane impairs m6A-mediated mRNA translation and leads to fine motor and cognitive deficits七氟烷麻醉破壞m6A介導的mRNA翻譯并導致精細運動和認知障礙
時間：2021
期刊：Cell Biology and Toxicology
影響因子：IF 6.691
技術平臺：m6A-seq（MeRIP-seq）、RIP實驗(RNA結合蛋白免疫沉淀) 、scRNA-seq
研究摘要：
本研究探索了全麻藥物對嬰幼兒精細運動能力損傷的機制，并首次關注了m6A甲基化在七氟烷麻醉影響精細運動損傷中的作用和機制。
以前的研究發(fā)現(xiàn)全麻藥物引起的神經(jīng)發(fā)育毒性機制在非人靈長類和嚙齒類動物模型之間尚存在一定的差異，比如臨床上觀察到多次全麻和手術引起嬰幼兒患者遠期語言和社交能力的降低和非人靈長類動物模型觀察到麻醉后多種社交行為能力的損害，但是多次的麻醉的幼鼠卻很難觀察到社交能力的損害。研究人員認為在全麻藥物引起認知損傷的非人靈長類模型和嚙齒類模型中，肯定有同向變化的基因，也肯定有相反變化的基因，應該在臨床上找尋出引起全麻藥物神經(jīng)發(fā)育毒性的關鍵科學問題，然后使用非人靈長類動物獼猴去探索全麻藥物引起神經(jīng)發(fā)育毒性的機制線索，之后找到獼猴和小鼠具有相同變化的靶基因，使用小鼠模型來進行驗證。
基于這個理念，研究人員聚焦到了使用非人靈長類動物和嚙齒類動物來研究全麻藥物與術后遠期精細運動損傷的機制。m6A修飾是在RNA甲基化修飾中最豐富的一種，YTHDF1是m6A甲基化的識別蛋白之一。最近的研究發(fā)現(xiàn)其可以參與神經(jīng)認知的形成和發(fā)展。在隨后的機制研究中，研究發(fā)現(xiàn)七氟烷麻醉后的幼年靈長類和嚙齒類動物的大腦中m6A結合蛋白YTHDF1表達顯著下調(diào)。單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）發(fā)現(xiàn)sp8陽性的神經(jīng)元中YTHDF1的表達下降在中間神經(jīng)元中最為明顯，而這部分神經(jīng)元，后續(xù)會發(fā)育成VIP中間神經(jīng)元。YTHDF1的功能主要是識別RNA上的甲基化位點。通過RIP實驗(RNA結合蛋白免疫沉淀)和m6A-seq測序分析發(fā)現(xiàn)m6A被高度富集在突觸素(Synaptophysin)的mRNA上，同時Synaptophysin的mRNA上有YTHDF1的結合位點。早先的研究發(fā)現(xiàn)Synaptophysin和全麻藥物的神經(jīng)發(fā)育毒性緊密相關。過表達YTHDF1可以回救七氟烷引起的幼年小鼠精細運動能力和認知功能障礙以及Synaptophysin的變化。研究認為YTHDF1是以m6A甲基化依賴性方式調(diào)控其下游靶基因Synaptophysin的表達，繼而損傷小鼠的精細運動能力和認知功能。本研究探索了全麻藥物對嬰幼兒精細運動能力損傷的機制，有望為預防或治療全麻藥的神經(jīng)發(fā)育毒性提供新的思路。
02 豬胚胎期骨骼肌發(fā)育：MeRIP-seq + RNA-seq
標題：Longitudinal epitranscriptome profiling reveals the crucial role of N6-methyladenosine methylation in porcine prenatal skeletal muscle development縱向轉錄組分析揭示了m6A甲基化修飾在豬胚胎期骨骼肌發(fā)育中的重要作用
時間：2020
期刊：Journal of Genetics and Genomics
影響因子：IF 5.065
技術平臺：m6A-seq（MeRIP-seq）、RNA-seq、IGF2BP1 RIP-seq
摘要：m6A是最豐富的一類mRNA修飾，可以促進骨骼肌的發(fā)育。然而m6A甲基化在胚胎期骨骼肌生成中的狀態(tài)和功能仍不清楚。研究人員首先證明METTL14（一種m6A甲基轉移酶）沉默可抑制成肌細胞的分化，促進C2C12 成肌細胞增殖。采用m6A-seq（MeRIP-seq）測序方法，對豬骨骼肌發(fā)育六個胚胎期的縱向轉錄組和表觀轉錄組圖譜進行分析，結果顯示：胚胎期骨骼肌發(fā)育六個不同階段的m6A修飾呈現(xiàn)高度的動態(tài)變化，且大多數(shù)受影響的基因在與骨骼肌發(fā)育相關的通路中富集。IGF2BP1 RIP-seq證實了胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白1(IGF2BP1)靶向與骨骼肌發(fā)育相關通路的76個基因，包括關鍵肌肉發(fā)育標記基因MYH2和MyoG。此外 siRNA介導的 IGF2BP1沉默可抑制成肌細胞分化，促進其增殖，類似于METTL14 沉默所觀察到的表觀遺傳變化。本研究不僅闡明了肌肉發(fā)育中m6A甲基化的動力學，且確定了參與豬胚胎期骨骼肌發(fā)育基因表達的關鍵基因。
背景
m6A是最豐富的一類mRNA修飾，可以促進骨骼肌的發(fā)育。然而m6A甲基化在胚胎期骨骼肌生成中的狀態(tài)和功能仍不清楚。
方法
研究人員首先證明METTL14（一種m6A甲基轉移酶）沉默可抑制成肌細胞的分化，促進C2C12 成肌細胞增殖。采用m6A-seq（MeRIP-seq）測序方法，對豬骨骼肌發(fā)育六個胚胎期的縱向轉錄組和表觀轉錄組圖譜進行分析。
關鍵圖形
03 斑馬魚和小鼠模型脊髓再生：MeRIP-seq + RNA-seq
標題：Epitranscriptomic m6A regulation following spinal cord injury脊髓損傷后的表觀轉錄組 m6A 調(diào)節(jié)
時間：2021
期刊：J Neurosci Res
影響因子：IF 4.164
技術平臺：m6A-seq（MeRIP-seq）、qRT-PCR、RNA-seq
摘要：
RNA甲基化參與多種生理和病理過程。然而，RNA甲基化在脊髓再生中的作用尚未報道。在這項研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)斑馬魚脊髓損傷（SCI）后m6A（N6-甲基腺苷）RNA甲基化圖譜發(fā)生改變，與m6A甲基化酶METTL3的轉錄水平改變一致。且許多與神經(jīng)再生相關的差異m6A標記基因被低甲基化，但它們的轉錄水平在SCI中上調(diào)。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)METTL3可能對脊髓再生很重要。另外，研究結果還顯示了小鼠SCI模型中METTL3變化的保守特征，即星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)干細胞中METTL3的表達水平均增加?？傊?，結果表明，脊髓損傷后m6A RNA甲基化是動態(tài)和保守的，可能有助于脊髓再生。
04人結腸癌細胞的mRNA m6A修飾及表達：MeRIP-seq + RNA-seq
標題：Effect of Humantenine on mRNA m6A Modification and Expression in Human Colon Cancer Cell Line HCT116 （Humantenine對人結腸癌細胞HCT116的 mRNA m6A修飾及表達的影響）
時間：2022
期刊：Genes (Basel)
影響因子：IF 4.096
技術平臺：m6A-seq（MeRIP-seq）、RNA-seq
摘要：
胡蔓藤堿乙（Humantenine）是一種從藥用草藥鉤吻（學名:Gelsemium elegans(Gardner & Chapm.) Benth.）中分離出來的生物堿。據(jù)報道會引起腸道刺激，但潛在的毒理學機制仍不清楚。本研究旨在研究經(jīng)Humantenine處理的人結腸癌細胞系HCT116中的 RNA m6A 修飾和不同的 mRNA 轉錄組圖譜。作者通過高通量的MeRIP-seq和對應的mRNA-seq分析，揭示了異常的RNA m6A修飾和mRNA表達在Humantenine誘導的腸細胞毒性中的作用。結果發(fā)現(xiàn)HCT116細胞經(jīng)Humantenine處理后，差異mRNA m6A修飾和差異mRNA表達中有1401個重疊基因。KEGG通路和GO富集分析結果表明，細胞骨架(actin cytoskeleton)、緊密連接(tight junctions)、粘著連接(adherens junctions)富集，共有11個RNA m6A甲基化調(diào)控因子出現(xiàn)差異表達，Humantenine組中靶基因的m6A甲基化發(fā)生紊亂。綜上所述，本研究提示Humantenine誘導的HCT116 細胞損傷與mRNA m6A 調(diào)控因子異常表達及靶基因m6A甲基化水平紊亂相關。
05 小獼猴模型麻醉后的m6A甲基化變化：MeRIP-seq + RNA-seq
標題：Epitranscriptomic Analysis of N6-methyladenosine in Infant Rhesus Macaques after Multiple Sevoflurane Anesthesia多次七氟烷麻醉后小獼猴的m6A表觀轉錄組學分析
時間：2022
期刊：Neuroscience
影響因子：IF 3.59
技術平臺：m6A-seq（MeRIP-seq）、RNA-seq
研究摘要：
迄今為止的臨床研究表明，接觸麻醉劑可能與神經(jīng)發(fā)育缺陷有關。七氟烷是兒科患者最常用的全身麻醉藥。動物研究表明，出生后多次接觸七氟烷會導致神經(jīng)病理性腦改變和長期認知缺陷。然而其潛在機制仍不清楚。在這項研究中，研究人員利用甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）繪制了小獼猴前額葉皮質(zhì)的全基因組RNA N6甲基腺苷（m6A）圖譜。七氟烷組獼猴的m6A peak值比對照組獼猴高（p≤ 0.05)。七氟烷處理后，YTHDF1蛋白和YTHDF3蛋白的mRNA表達水平降低，表明七氟烷麻醉動態(tài)調(diào)節(jié)RNA m6A甲基化。GO富集分析表明，七氟烷暴露后，m6A位點甲基化增加的基因在一些與神經(jīng)發(fā)育相關的生理過程中富集，主要集中在突觸可塑性（Synaptic plasticity）上。分析發(fā)現(xiàn)，雌性獼猴有18個高甲基化基因，雄性獼猴有35個高甲基化基因，且在與突觸結構調(diào)節(jié)相關的一些生理過程中富集。由于獼猴的基因上與人類十分接近，本研究發(fā)現(xiàn)有助于在轉錄水平上研究七氟烷相關神經(jīng)發(fā)育缺陷的機制，并為新生兒麻醉暴露的神經(jīng)毒性的潛在臨床預防和干預提供新的見解。
關于易基因RNA m6A甲基化測序(MeRIP-seq)技術
易基因MeRIP-seq技術利用m6A特異性抗體富集發(fā)生m6A修飾的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），結合高通量測序，可以對RNA上的m6A修飾進行定位與定量，總RNA起始量可降低至10μg，最低僅需1μg總RNA。廣泛應用于組織發(fā)育、干細胞自我更新和分化、熱休克或DNA損傷應答、癌癥發(fā)生與發(fā)展、藥物應答等研究領域；可應用于動物、植物、細胞及組織的m6A檢測。
大樣本量m6A-QTL性狀關聯(lián)分析，傳統(tǒng)MeRIP單個樣品價格高，通常難以承擔。易基因開發(fā)建立MeRIP-seq2技術，顯著提成IP平行性，實現(xiàn)不同樣本間相對定量，降低檢測成本。
易基因提供適用于不同科研需求的MeRIP技術：
m6A甲基化-常量mRNA 甲基化測序（MeRIP-seq）
m6A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化測序（lnc-MeRIP-seq）
m6A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化測序（Micro-lnc-MeRIP-seq）
高通量m6A甲基化-常量mRNA甲基化測序（MeRIP-seq2）
技術優(yōu)勢：
起始量低：樣本起始量可降低至10-20μg，最低僅需1μg總RNA；
轉錄組范圍內(nèi)：可以同時檢測mRNA和lncRNA；
樣本要求：可用于動物、植物、細胞及組織的m6A檢測；
重復性高：IP富集重復性高，最大化降低抗體富集偏差；
應用范圍廣：廣泛應用于組織發(fā)育、干細胞自我更新和分化、熱休克或DNA損傷應答、癌癥的發(fā)生與發(fā)展、藥物應答等研究領域。
研究方向：
m6A甲基化目前主要運用在分子機制的理論性研究
疾病發(fā)生發(fā)展：腫瘤、代謝疾?。ㄈ绶逝?糖尿病）、神經(jīng)和精神疾病（如阿爾茲海默癥/抑郁癥）、炎癥…
發(fā)育和分化：早期胚胎發(fā)育、個體/組織/器官生長發(fā)育、干細胞分化與命運決定、衰老
環(huán)境暴露與響應：污染、抗逆、生活方式
關于m6A甲基化研究思路
（1）整體把握m6A甲基化圖譜特征：m6A peak數(shù)量變化、m6A修飾基因數(shù)量變化、單個基因m6A peak數(shù)量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修飾基因的功能分析
（2）篩選具體差異m6A peak和基因：差異m6A peak鑒定、非時序數(shù)據(jù)的分析策略、時序數(shù)據(jù)的分析策略、差異m6A修飾基因的功能分析、差異m6A修飾基因的PPI分析、候選基因的m6A修飾可視化展示
（3）m6A甲基化組學&轉錄組學關聯(lián)分析：Meta genes整體關聯(lián)、DMG-DEG對應關聯(lián)、m6A修飾目標基因的篩選策略
（4）進一步驗證或后期試驗
科研合作，找易基因，發(fā)文快！
參考文獻：
DOI:10.1007/s10565-021-09601-4
DOI:10.1002/jnr.24763
DOI:10.1016/j.neuroscience.2021.11.030
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