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西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院博士研究生王善禾和李芳為共同第一作者、王昕教授和榆林學(xué)院屈雷教授為共同通訊作者以“Integrative Analysis of Methylome and Transcriptome Reveals the Regulatory Mechanisms of Hair Follic”為題在《Cells》雜志上發(fā)表研究論文，通過全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）和對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）聯(lián)合分析揭示了陜北絨山羊早期毛囊形態(tài)發(fā)生的調(diào)控機制。
標(biāo)題：Integrative Analysis of Methylome and Transcriptome Reveals the Regulatory Mechanisms of Hair Follic（甲基化組和轉(zhuǎn)錄組的綜合分析揭示了絨山羊毛囊形態(tài)發(fā)生的調(diào)控機制）
時間：2020.04.14
期刊：Cells
影響因子：IF 7.666
技術(shù)平臺：WGBS、RNA-seq
樣本：陜北絨山羊胚胎期65天（E65）和120天(E120)皮膚組織，各3個樣本，共6個
實驗：WGBS、RNA-seq、甲基化組與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析、染色實驗、實驗驗證（qRT-PCR、半定量RT-qPCR、BSP）
摘要：
先前對人和小鼠的研究表明，毛囊形態(tài)發(fā)生依賴于緊密協(xié)調(diào)的外胚層-中胚層互作，包括多種信號和調(diào)控因子。DNA甲基化和長鏈非編碼RNA（lncRNA）通過調(diào)控基因表達在早期胚胎皮膚發(fā)育中起關(guān)鍵作用。lncRNA作為一種間接調(diào)控因子，可以將DNA甲基轉(zhuǎn)移酶招募到特定的基因組位點，從而導(dǎo)致DNA甲基化。然而絨山羊毛囊形態(tài)發(fā)生的分子調(diào)控機制尚不清楚。
為揭示絨山羊胚胎期毛囊形態(tài)發(fā)生的復(fù)雜調(diào)控過程，本研究采用RNA-seq測序分析和全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）技術(shù)對絨山羊胚胎期第65天（E65）和第120天（E120）的皮膚組織進行研究分析。RNA-seq、qRT-PCR和免疫組化結(jié)果表明，Wnt信號在毛囊誘導(dǎo)和分化階段都起重要作用；轉(zhuǎn)錄因子（TFs），包括HOXC13、SOX9、SOX21、JUNB、LHX2、VDR和GATA3，通過在E120的特異性表達參與毛囊分化。隨后，WGBS和RNA-seq關(guān)聯(lián)分析表明，一些毛囊分化基因和TF基因的表達與DNA甲基化水平總體呈負相關(guān)。部分毛囊分化基因在毛囊誘導(dǎo)階段被甲基化和抑制，但隨后在毛囊分化階段被去甲基化和表達，表明DNA甲基化通過調(diào)控相關(guān)基因表達在毛發(fā)形態(tài)發(fā)生中起重要作用。此外，通過lncRNA圖譜鑒定出E120與E65中45個上調(diào)和147個下調(diào)lncRNA，揭示了與靶基因DNA甲基化相關(guān)的潛在差異表達lncRNA?？傊?，在絨山羊毛囊形態(tài)發(fā)生過程中揭示了關(guān)鍵信號和基因。此過程中，與毛囊誘導(dǎo)階段相比，毛囊分化過程中的DNA甲基化水平較低，可能通過調(diào)控相關(guān)基因表達在毛發(fā)形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮重要作用。另外，本還描述了與靶基因上DNA甲基化相關(guān)的潛在lncRNA，豐富了毛發(fā)形態(tài)發(fā)生的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子機制。
結(jié)果圖形
（1）絨山羊毛囊誘導(dǎo)與分化階段的形態(tài)研究
圖1：陜北絨山羊胚胎E65和E120在毛囊發(fā)育過程中的皮膚形態(tài)
（2）毛囊誘導(dǎo)和分化的不同分子特征
圖2：RNA-seq 揭示了毛囊誘導(dǎo)和分化過程的差異表達基因(DEGs)和關(guān)鍵信號通路。
（a）RNA-seq樣品準(zhǔn)備的工作流程；
（b）E65和E120之間的DEGs熱圖。
（c）E65和E120 之間的DEG的KEGG通路圖。
圖3：毛囊誘導(dǎo)和分化差異表達基因驗證
圖4：免疫組化（IHC）驗證羊絨皮膚組織上Pc和DC細胞的特異性基因。
（3）毛囊誘導(dǎo)和分化過程中的Wnt信號
圖5：IHC檢測毛囊誘導(dǎo)期和分化期β-連環(huán)蛋白、WLS和FZD10表達
（4）皮膚毛囊發(fā)育的LncRNA分析
圖6：絨山羊E65和E120皮膚組織的lncRNA鑒定和特征描述
圖7：LncRNA在不同時期的表達模式。結(jié)果與 RNA-seq 數(shù)據(jù)一致。
（5）形態(tài)發(fā)生過程中毛發(fā)誘導(dǎo)和分化的基因組DNA甲基化
圖8：mCG、mCHH和mCHG不同基因區(qū)域的甲基化水平。在全基因組范圍內(nèi)，E65在所有區(qū)域均表現(xiàn)出較高的CG甲基化狀態(tài)。在轉(zhuǎn)錄起始位點周圍的區(qū)域觀察到明顯的低甲基化。
圖9：E65和E120之間差異甲基化基因的熱圖和KEGG通路圖。共鑒定出3371個差異甲基化基因（DMG），KEGG分析顯示DMG在TGF-β富集。
E65和E120之間差異甲基化基因的熱圖。
E65和E120之間差異甲基化基因的KEGG通路。
（6）WGBS和mRNA-seq數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析
圖10：E65和E120之間的差異甲基化基因和差異表達基因之間的維恩圖。與E65相比，547個低甲基化基因在E120中高表達，而282個高甲基化基因2在E120中低表達。
圖11：差異甲基化基因及其表達驗證。BSP（Bisulfite Sequencing Polymerase Chain Reaction）檢測的DNA甲基化與WGBS結(jié)果一致，基因表達結(jié)果與RNA-seq一致，其中基因表達受高DNA甲基化抑制。
結(jié)論：
本研究利用全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）和轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）技術(shù)，對早期胚胎皮膚發(fā)育的調(diào)控機制進行了研究，發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路在毛囊誘導(dǎo)和分化過程中發(fā)揮重要作用，HOXC13, SOX9, SOX21, JUNB, LHX2, VDR 和 GATA3等轉(zhuǎn)錄因子在胚胎期120天特異性表達參與毛囊分化。說明DNA甲基化能夠通過影響基因的表達在毛囊形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮重要作用。與此同時，發(fā)現(xiàn)lnc-00205，lnc-007623和lnc-000374在胚胎期120天特異性表達，此時它們的靶基因處于高度甲基化，這一結(jié)果表明一些關(guān)鍵的差異lncRNA通過調(diào)控靶基因的甲基化而在絨山羊皮膚毛囊早期發(fā)育中發(fā)揮重要作用。該研究揭示了lncRNA和DNA甲基化在調(diào)控陜北絨山羊毛囊形態(tài)發(fā)生中的重要作用，豐富了毛囊形態(tài)發(fā)生的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子機制。
關(guān)于易基因全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）技術(shù)
全基因組重亞硫酸鹽甲基化測序（WGBS）可以在全基因組范圍內(nèi)精確的檢測所有單個胞嘧啶堿基（C堿基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金標(biāo)準(zhǔn)。WGBS能為基因組DNA甲基化時空特異性修飾的研究提供重要技術(shù)支持，能廣泛應(yīng)用在個體發(fā)育、衰老和疾病等生命過程的機制研究中，也是各物種甲基化圖譜研究的首選方法。
易基因提供的全基因組甲基化測序技術(shù)通過T4-DNA連接酶，在超聲波打斷基因組DNA片段的兩端連接接頭序列，連接產(chǎn)物通過重亞硫酸鹽處理將未甲基化修飾的胞嘧啶C轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏，進而通過接頭序列介導(dǎo)的 PCR 技術(shù)將尿嘧啶U轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏。
應(yīng)用方向：
WGBS廣泛用于各種物種，要求全基因組掃描（不錯過關(guān)鍵位點）
全基因組甲基化圖譜課題
標(biāo)志物篩選課題
小規(guī)模研究課題
技術(shù)優(yōu)勢：
應(yīng)用范圍廣：適用于所有參考基因組已知物種的甲基化研究；
全基因組覆蓋：最大限度地獲取完整的全基因組甲基化信息，精確繪制甲基化圖譜；
單堿基分辨率：可精確分析每一個C堿基的甲基化狀態(tài)。
易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整體解決方案，技術(shù)詳情了解請致電易基因0755-28317900。
參考文獻：
Wang S, Li F, Liu J, Zhang Y, Zheng Y, Ge W, Qu L, Wang X. Integrative Analysis of Methylome and Transcriptome Reveals the Regulatory Mechanisms of Hair Follicle Morphogenesis in Cashmere Goat. Cells. 2020 Apr 14;9(4) pii: cells9040969.
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