摘要▼
分子診斷技術的發(fā)展加速推進了兒童感染性疾病病原體核酸檢測向高通量、高靈敏度、自動化發(fā)展的進程。在臨床常用的熒光定量PCR技術之外，多重PCR技術、數(shù)字PCR技術、等溫擴增技術、微流控芯片的應用使病原體核酸檢測在通量和靈敏度上有了顯著提升，這些技術配合一體機的使用實現(xiàn)了兒童感染性疾病病原體核酸檢測的自動化和高通量化。高通量測序技術可以最大程度獲取標本中幾乎所有病原體的核酸信息，已逐漸成為臨床感染性疾病診斷的重要輔助手段。
由于兒童免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未完善，感染性疾病成為兒童最為常見的疾病，2013年全球有3.26億5歲以下兒童死于感染性疾病，占所有5歲以下兒童死亡數(shù)的50%以上。病原微生物的早期、快速、準確診斷在感染性疾病的診斷、治療和預防中起著至關重要的作用。隨著近年來分子診斷技術的不斷創(chuàng)新，感染性疾病病原體核酸檢測技術也取得了快速發(fā)展和廣泛應用。
一、兒童臨床病原體核酸檢測現(xiàn)狀及挑戰(zhàn)
兒童感染性疾病具有病原微生物多樣性、復雜性、載量低等特點。目前，病原學核酸檢測主要依賴于PCR技術，尤以熒光定量PCR技術的應用最為廣泛。熒光定量PCR技術因其實時定量、閉管檢測、特異性強等優(yōu)點，被廣泛應用于細菌、病毒、真菌、支原體、衣原體和病原體耐藥基因等臨床病原學核酸檢測領域。但該技術也存在通量過低、檢測靈敏度有限等缺點，不適用于臨床多種病原體的同時檢測以及特殊低載量病原體樣本的檢測。同時，國內各級醫(yī)療機構感染性PCR實驗室自動化程度不高，也限制了該技術進一步的臨床應用。自動化、高通量、高靈敏度必然是未來兒童感染性疾病核酸檢測的發(fā)展方向。
二、兒童病原體核酸檢測技術的發(fā)展及臨床應用
（一）基于PCR技術的病原體核酸檢測
為了克服熒光定量PCR技術通量低、靈敏度有限的缺點，目前新開發(fā)的臨床常見病原體核酸檢測技術主要包括多重PCR技術和數(shù)字PCR技術。
1．多重PCR技術：
主要應用多重引物，針對不同的病原體核酸或耐藥基因進行特異性擴增，根據(jù)不同病原體擴增產物的長度差異來判斷何種病原體感染，也可以同時檢測同一樣本中的細菌、病毒、支原體等臨床常見病原體及其耐藥基因。該技術早期主要通過凝膠電泳和毛細管電泳人工來判斷結果，如黃烈等建立了多重PCR技術同時檢測流感A、流感B、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒等9種兒童常見的呼吸道病毒，最終通過凝膠電泳分析PCR產物大小來判斷病毒類型；張海鄰等建立了同時檢測病毒、衣原體等11種兒童常見呼吸道感染病原微生物的多重PCR體系，檢測結果通過毛細管電泳法進行分析。但該技術存在擴增產物易污染的缺點。近幾年一些企業(yè)已將PCR擴增和毛細管電泳做成一體機用于兒童感染性疾病的病原學檢測，封閉檢測降低了核酸污染機率，并通過機器判讀結果，減少了檢驗人員的操作誤差和工作量。一體機使PCR技術擺脫了場地和熒光定量PCR儀的限制，更適合門診或基層兒童感染性疾病病原學核酸檢測的快速普及。
2．數(shù)字PCR技術：
包含列陣數(shù)字PCR、磁珠乳液擴增方法（beads，emulsion，amplification，and magnetics，BEAMing）數(shù)字PCR和微滴數(shù)字PCR。其中微滴數(shù)字PCR應用最為廣泛，該系統(tǒng)要求在傳統(tǒng)PCR擴增前把測試樣本分割為成千上萬的水包油微滴，分割后每個微滴成為1個獨立的PCR反應體系，可以實現(xiàn)病原微生物的絕對定量，將PCR靈敏度提升了10~100倍。在兒科感染領域，微滴數(shù)字PCR主要應用于細菌、病毒、真菌和寄生蟲等病原微生物的精準定量檢測，如結核桿菌、HBV、HIV和瘧原蟲等，進而指導臨床診斷和治療[10,11,12]。
（二）基于等溫擴增技術的病原體核酸檢測
等溫擴增技術可以實現(xiàn)恒定溫度下擴增目標核酸片段，不僅避免了PCR反應的升、降溫過程，縮短了擴增時間，而且擺脫了PCR儀的限制，能更好地適用于基層醫(yī)院。依據(jù)等溫擴增酶及引物設計的特性，等溫擴增技術主要包括環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、實時熒光核酸恒溫擴增（simultaneous amplification and testing，SAT）、酶促重組等溫擴增（Enzymatic Recombinase Amplification，ERA）。
1．LAMP技術：
在病原體核酸的6個區(qū)域設計4條引物，通過一系列的鏈置換擴增反應來實現(xiàn)病原體基因片段的擴增，由于在體系中加入了Mn2+鈣黃綠素復合物，擴增反應產生的大量焦磷酸根離子可與Mn2+結合釋放鈣黃綠素，因而有利于反應結果的觀測，使擴增和檢測只需一步便可完成，大大提高了檢測效率。但LAMP技術難以區(qū)別非特異性擴增和極易受污染影響而產生假陽性結果。
2．SAT技術：
將病原體靶RNA逆轉錄為互補DNA（complementary DNA，cDNA），再利用T7噬菌體酶將cDNA轉錄為RNA，通過頸環(huán)RNA探針識別RNA產物釋放熒光，然后產物RNA不斷重復上述過程，由于每個循環(huán)可放大100~1 000倍熒光信號，其靈敏度至少可以達到101CFU/ml，優(yōu)于熒光定量PCR技術。同時，SAT技術的靶標為RNA，可提示以DNA為核酸的病原體的現(xiàn)癥感染，目前在兒科感染領域已廣泛應用于兒童肺炎支原體和結核桿菌的診斷和療效監(jiān)測。
3．ERA技術：
該技術可以在恒定的低溫下（25℃-42℃）對痕量的支原體種內保守性DNA片段進行特異性的擴增，樣本的處理只需吸取200微升的細胞懸95℃水浴2分鐘作為模板，反應體系需置于熒光定量檢測儀中進行，設置溫度為37℃，擴增反應可以在20分鐘內完成，觀察熒光定量檢測儀顯示的擴增曲線判讀檢測結果。
該產品現(xiàn)處于科研品，是一種恒溫核酸擴增方法，靈敏度比PCR高10-100倍，可以在恒定的低溫條件下進行，而且用時在30分鐘以內，并且檢測范圍涵蓋130種支原體，是一種比較理想的支原體檢測方法。
（三）基于基因芯片技術的病原體核酸檢測
基因芯片是將特異的寡核苷酸片段以高密度排列在片基上，與目的片段進行識別和雜交，通過特定的檢測系統(tǒng)和分析系統(tǒng)進行結果判讀。根據(jù)檢測靶標的不同，基因芯片主要包括DNA芯片和RNA芯片。近年來兒科感染性疾病病原體檢測領域發(fā)展最快的是微流控芯片技術。核酸檢測微流控芯片將不同的實驗室系統(tǒng)縮微在玻璃或者塑料基質上，在微米級的尺度上構建出液流通道、核酸提取池、逆轉錄和PCR擴增池、雜交池等部件，整合了樣本處理、反應、檢測的全部過程，可以實現(xiàn)高通量檢測多種病原體或進行病原微生物的分型，但目前尚存在單次檢測樣本量過低的缺點。微流控技術在檢測諾如病毒、輪狀病毒、星狀病毒等兒童常見腹瀉病毒方面的應用已有文獻報道，未來該技術有望為兒科感染性疾病的病原學檢測注入新的活力。
三、結語與展望
分子診斷技術的發(fā)展加快了兒童感染性疾病病原學診斷的進程。PCR技術依然是兒童感染性疾病病原體核酸檢測的主要檢測方法。微流控技術可以實現(xiàn)病原體核酸檢測的高通量、自動化，適合臨床兒童感染的多種病原篩查，有望顯著提高兒童感染性疾病病原學診斷的能力和效率?？梢灶A見，分子診斷技術推動下的兒童感染性疾病病原體核酸檢測技術未來必然朝著高通量、自動化的方向發(fā)展，成為感染性疾病診斷的主要方法。
