最近一段時(shí)間正是國(guó)自然標(biāo)書(shū)撰寫(xiě)進(jìn)入最后的沖刺階段，相信很多科研工作者們都已經(jīng)擬好內(nèi)容，只差潤(rùn)色了。但是不知道這兩年的國(guó)自然一線明星外泌體，大家的內(nèi)容里都靠上了沒(méi)？如果想靠但還沒(méi)有靠上的，需要抓緊時(shí)間了啊，還剩下最后的補(bǔ)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)的時(shí)間。下面我為大家將外泌體的知識(shí)再梳理一遍：
在說(shuō)外泌體之前，我們先介紹一下細(xì)胞外囊泡（Extracellular Vesicles， EVs）。細(xì)胞外囊泡是細(xì)胞以多種形式分泌到細(xì)胞外的各種囊泡：外泌體（Exosomes）直徑為30-150nm，以?xún)?nèi)吞的形式釋放到細(xì)胞外；微囊泡（Microvesicles）直徑為100-1000nm，以出芽的形式釋放到細(xì)胞外；凋亡小體（Apoptotic body）直徑為50-2000nm，由凋亡細(xì)胞產(chǎn)生。由于各種胞外囊泡的大小可能有交叉，所以要想通過(guò)分離手段得到某種純化的特定囊泡是很難實(shí)現(xiàn)的。
圖一 胞外囊泡的分泌 （圖片來(lái)源于文獻(xiàn)）
外泌體攜帶有細(xì)胞來(lái)源相關(guān)的多種蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和核酸，其中蛋白質(zhì)包括跨膜蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、細(xì)胞支架蛋白、酶等，現(xiàn)在很多文獻(xiàn)會(huì)選擇其中的幾種膜蛋白和膜內(nèi)蛋白作為外泌體的鑒定標(biāo)志物，核酸包括DNA、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等，這些組分參與了細(xì)胞的各種代謝以及生理活動(dòng)的變化。
圖二 外泌體組分分布（圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)）
為什么要研究外泌體？
外泌體是細(xì)胞與細(xì)胞間通訊中起關(guān)鍵作用的胞外基質(zhì)成分，廣泛參與細(xì)胞間物質(zhì)運(yùn)輸與信息傳遞，調(diào)控細(xì)胞生理活動(dòng)；同時(shí)，外泌體具有抗原提呈、免疫逃逸等免疫調(diào)節(jié)作用和誘導(dǎo)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移的作用；此外，外泌體還可以作為“天然的納米粒子”來(lái)進(jìn)行藥物遞送，裝載的藥物類(lèi)型包括小分子化學(xué)藥物、蛋白質(zhì)和肽、核酸藥物等。
外泌體相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)有哪些？
exoRBase（http://www.exoRBase.org）數(shù)據(jù)庫(kù)收集和描述人類(lèi)血液外泌體中所有長(zhǎng)的RNA，提供了注釋、表達(dá)水平和可能的來(lái)源組織。
EVpedia（http://student4.postech.ac.kr/evpedia2_xe/xe/）數(shù)據(jù)庫(kù)匯總了不同囊泡研究中發(fā)現(xiàn)的蛋白、mRNA、miRNA、脂類(lèi)等。
Vesiclepedia（http://microvesicles.org/index.html）數(shù)據(jù)庫(kù)不僅收錄了外泌體中的脂質(zhì)、RNA和蛋白質(zhì)，還有微囊泡、凋亡小體等囊泡類(lèi)型的信息。
ExoCarta（http://exocarta.org/index.html）數(shù)據(jù)庫(kù)主要收錄了包括人、大鼠、小鼠、綿羊、豚鼠、果蠅、馬、穴兔、牛在內(nèi)的幾個(gè)物種的286個(gè)研究結(jié)果，含蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA和脂質(zhì)等信息。
如何獲得外泌體樣本及預(yù)處理？
外泌體廣泛存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清以及各種體液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等。不同的樣本來(lái)源，預(yù)處理及注意細(xì)節(jié)均不同，下面我們選取幾種常見(jiàn)的樣本分別介紹樣本處理的要求：
細(xì)胞培養(yǎng)上清：選用這種樣本的優(yōu)勢(shì)是不會(huì)受到樣本量的限制，但是需要注意以下幾點(diǎn)：一是一定不能添加含有外泌體的FBS；二是細(xì)胞一般培養(yǎng)24-48h后即可分離外泌體；三是注意細(xì)胞不允許有污染、細(xì)胞死亡率要控制在5%之內(nèi)。
血清/血漿：選用血液作為樣本時(shí)，要注意血清和血漿的區(qū)別。血清是血液凝固之后收集的液體，如果研究與血小板相關(guān)的疾病，選用血清作為樣本比較合適；血漿是血液去除了血細(xì)胞之后得到的液體，一般情況下選擇血漿更合適。盡量在采血30min內(nèi)處理樣本，同時(shí)還應(yīng)注意采血的針頭大小以及取樣的定點(diǎn)定時(shí)。
尿液：選用尿液作為樣本時(shí)，一方面要注意選取中間段的尿液，確保尿液的新鮮度；另一方面收集樣本后，要添加硫柳汞鈉抑菌劑，防止尿液被污染。
卵泡液：生殖系統(tǒng)的樣本是現(xiàn)在外泌體研究的一個(gè)重要系統(tǒng)，在不同的生理狀態(tài)下卵泡液分泌的外泌體內(nèi)容物會(huì)有不同。卵泡液的粘度比較大，分離難度相對(duì)大一點(diǎn)，在分離之前可能需要先濃縮。
腦脊液：神經(jīng)系統(tǒng)這塊目前有很多科研人員在用外泌體做功能和機(jī)制研究，其中腦脊液是神經(jīng)系統(tǒng)做外泌體選擇的比較合適的樣本，但是腦脊液由于很難獲得，一定程度上限制了外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)中的應(yīng)用。
乳汁：乳汁中會(huì)分泌一些外泌體，供新生兒吸收。乳汁中的外泌體受母親的膳食、健康狀況、精神狀態(tài)等影響比較大。此外，乳汁中含有的大量脂蛋白會(huì)影響外泌體的分離。
關(guān)節(jié)積液：骨科的外泌體研究項(xiàng)目越來(lái)越多，那么關(guān)節(jié)積液也是經(jīng)常遇見(jiàn)的一種需要分離外泌體的樣本。關(guān)節(jié)積液的外泌體含量不高，但是獲得量容易受限制。
圖三 樣本來(lái)源示意圖
如何分離外泌體？
我們可以通過(guò)不同的分離方法從生物體液中進(jìn)行外泌體分離，下面選取幾種方法分別做介紹：
差速超速離心：差速超速離心是大家最熟悉的一種分離方法，文獻(xiàn)中用得最多的且也是目前比較能受到認(rèn)可的方法。差速超速離心是先通過(guò)低速離心去除細(xì)胞和細(xì)胞凋亡碎片，再通過(guò)超高速去除大囊泡和沉淀外泌體。此方法分離得到的外泌體可用于后續(xù)的鑒定實(shí)驗(yàn)、分子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
密度梯度離心：此方法多指蔗糖密度梯度超速離心。此方法從不同密度的顆粒中分離出囊泡，對(duì)離心的時(shí)間比較敏感。如果外泌體和顆粒密度相似，外泌體可能會(huì)被其他顆粒污染。
超濾：超濾過(guò)程中需要用超濾膜進(jìn)行外泌體隔離。在分離過(guò)程中，外泌體可能會(huì)阻塞過(guò)濾孔，導(dǎo)致膜的壽命減短，分離效率較低。同時(shí)，外泌體會(huì)粘附在膜上，導(dǎo)致產(chǎn)量降低。
免疫磁珠法：用包被抗標(biāo)記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結(jié)合，即可將外泌體吸附并分離出來(lái)。該方法分離得到的外泌體的生物活性易受pH和鹽濃度影響，不利于下游實(shí)驗(yàn)。
試劑盒分離法：目前商業(yè)化的外泌體提取試劑盒多種多樣，提取效果良莠不齊。同時(shí)試劑盒本身的價(jià)格比較高，且外泌體的得率和純度一般，不是性?xún)r(jià)比高的一種分離方法。此方法得到的外泌體對(duì)于后續(xù)的鑒定實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等可能有影響。
如何鑒定外泌體？
外泌體分離之后，需要經(jīng)過(guò)一系列鑒定才能確定分離的是外泌體。鑒定方法從物理特征到表面分子標(biāo)志物，多角度進(jìn)行鑒定。下面介紹幾種鑒定方法：
透射電鏡鑒定法：透射電鏡，全稱(chēng)為透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope，簡(jiǎn)稱(chēng)TEM），分辨率為0.1~0.2nm，適合外泌體雙層囊膜超微結(jié)構(gòu)觀察，用于鑒定樣本中是否存在外泌體樣結(jié)構(gòu)，即通常為茶托型或一側(cè)凹陷的半球形。
圖四 外泌體電鏡圖
濃度粒徑檢測(cè)法：納米顆粒跟蹤分析法，簡(jiǎn)稱(chēng)NTA（Nanoparticle Tracking Analysis），該技術(shù)已被外泌體研究領(lǐng)域認(rèn)可為外泌體表征手段之一。NTA技術(shù)的樣本處理簡(jiǎn)單、能保證外泌體原始狀態(tài)、檢測(cè)速度快，檢測(cè)后能提供外泌體粒徑和濃度信息。
圖五 外泌體NTA圖
Western Blot分子標(biāo)志物檢測(cè)： WB可以用來(lái)鑒定外泌體的標(biāo)志蛋白是否存在于樣本中。外泌體標(biāo)志蛋白包括四跨膜蛋白家族，如CD9、CD63和CD81；細(xì)胞質(zhì)蛋白，如肌動(dòng)蛋白（Actin）和鈣磷脂結(jié)合蛋白（Annexins）；參與生物功能的分子，如凋亡轉(zhuǎn)接基因2互作蛋白X（ALIX）、腫瘤易感基因101蛋白（TSG101）、熱休克蛋白（HSP70、HSP90），以及細(xì)胞分泌的特異性蛋白。其中CD9、CD63、HSP70、TSG101是外泌體常用的鑒定蛋白。
流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：外泌體可以先進(jìn)行熒光標(biāo)記，再通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)外泌體表面標(biāo)記蛋白。但是傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣本的顆粒大小是300-500nm，而外泌體直接都在300nm以下，因此，可能大量的外泌體檢測(cè)不到，造成分析不太準(zhǔn)確。
ELISA檢測(cè) ：根據(jù)外泌體的表面標(biāo)志物，如CD9、CD63進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，來(lái)檢測(cè)外泌體的蛋白量，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)外泌體的分析。但是ELISA方法容易受其他抗原的干擾，引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差。
如何檢測(cè)和研究外泌體？
外泌體內(nèi)含有與細(xì)胞來(lái)源相關(guān)的蛋白質(zhì)和核酸，可通過(guò)細(xì)胞膜受體直接激活受體細(xì)胞，也可運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA，甚至細(xì)胞器進(jìn)入受體細(xì)胞，參與細(xì)胞間通訊。通過(guò)高通量技術(shù)對(duì)外泌體RNA進(jìn)行分析，可快速高效獲得外泌體RNA的全面信息。不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體所含有的RNA和蛋白成分不太相同，可作為多種疾病的早期診斷標(biāo)記物，也能作為靶向藥物的載體進(jìn)行疾病治療。
外泌體microRNA測(cè)序/芯片：通過(guò)對(duì)外泌體microRNA的高通量分析，可以找到不同外泌體之間差異表達(dá)的microRNA，為后續(xù)的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
外泌體mRNA測(cè)序/芯片：通過(guò)對(duì)外泌體轉(zhuǎn)錄組測(cè)序或表達(dá)譜芯片分析，可以找出不同外泌體之間差異表達(dá)的mRNA，從而發(fā)現(xiàn)外泌體中哪些基因發(fā)生了變化。
外泌體lncRNA芯片：通過(guò)lncRNA芯片可以同時(shí)得到lncRNA和mRNA數(shù)據(jù)，為研究者提供更完整的lncRNA和mRNA篩查。
外泌體ceRNA芯片：競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）機(jī)制如下：microRNA（miRNA）處在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心，lncRNA分子富含miRNA結(jié)合位點(diǎn)，可以競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合miRNA，解除miRNA對(duì)其靶基因的抑制作用，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)水平。通過(guò)ceRNA芯片可以為研究者提供完整的lncRNA，circRNA和mRNA篩查。
外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)：主要包括iTRAQ蛋白質(zhì)組定量/TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)/label free蛋白質(zhì)組定量。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，尋找差異表達(dá)蛋白，并揭示其細(xì)胞生理病理功能。
外泌體的研究方向主要包括以下三個(gè)方面：
尋找疾病診斷和預(yù)后的分子標(biāo)志物。
揭示疾病發(fā)病機(jī)制，從微環(huán)境角度解釋細(xì)胞之間通訊促進(jìn)疾病發(fā)生的原因。
外泌體作為藥物載體，實(shí)現(xiàn)靶向給藥。
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