m6A是mRNA中最為普遍的核苷酸修飾，二代測(cè)序的結(jié)果顯示，有約1/4的mRNA包含有至少一個(gè)m6A修飾位點(diǎn)。m6A的修飾發(fā)生在RRACH的 motif中，在mRNA的3’UTR和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)豐度較高【1,2】。m6A修飾參與了mRNA代謝的各個(gè)過程中，包括但不限于轉(zhuǎn)錄后剪接、翻譯效率、mRNA穩(wěn)定性等方面的調(diào)控【3-6】。近年來的研究顯示，m6A可以影響多種細(xì)胞生物學(xué)過程，在細(xì)胞命運(yùn)決定、脂代謝、 免疫等方面都起著重要的作用【7,8】。m6A的精細(xì)調(diào)控機(jī)制及其生物學(xué)功能已經(jīng)成為RNA領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
即使m6A修飾對(duì)于細(xì)胞生物學(xué)過程的影響已經(jīng)研究多年，但是對(duì)于m6A修飾如何影響這些基本的生物學(xué)過程以及如何在不同的細(xì)胞環(huán)境下發(fā)揮不同的功能這些問題一直尚未解決。
2019年7月11日，來自Cornell University 的Samie R. Jaffrey課題組在Nature上發(fā)表了題為m6A enhances the phase separation potential of mRNA的文章，報(bào)道了m6A修飾可以促進(jìn)mRNA與YTHDF蛋白發(fā)生相分離從而影響了一系列的細(xì)胞生物學(xué)過程。
另外，幾乎同時(shí)，莊小威實(shí)驗(yàn)室也在bioRxiv上online了題為m6A-binding YTHDF proteins promote stress granule formation by modulating phase separation of stress granule proteins 的文章，也報(bào)道了這一現(xiàn)象。
Samie R. Jaffrey實(shí)驗(yàn)室長期致力于mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾的調(diào)節(jié)，在Nature等雜志發(fā)表了一些列高水平文章，并創(chuàng)建了RNA甲基化(m6A) 免疫共沉淀高通量測(cè)序 (MeRIP-Seq) 技術(shù)，從而可以在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)研究發(fā)生甲基化的RNA區(qū)域。作者在這篇文章中選取了經(jīng)典的m6A結(jié)合蛋白：YTHDF1（DF1）, YTHDF2（DF2） 和 YTHDF3（DF3）作為研究對(duì)象試圖揭開m6A對(duì)mRNA穩(wěn)定性以及其翻譯效率調(diào)控的具體機(jī)制。
對(duì)DF1, DF2 和 DF3的一級(jí)序列分析顯示，三個(gè)蛋白在結(jié)構(gòu)上高度保守，都含有一段約15kDa大小的用于結(jié)合m6A 的YTH結(jié)構(gòu)域，以及一段約40kDa的無序區(qū)（Low complexity domain）組成（下圖）。基于這一結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，作者推測(cè)，這三個(gè)蛋白可能會(huì)發(fā)生liquid-liquid phase separation（LLPS）現(xiàn)象。因此作者純化了在細(xì)胞內(nèi)含量最高的DF蛋白中的DF2蛋白。作者發(fā)現(xiàn)，在4攝氏度低溫的環(huán)境下，DF2蛋白溶液澄清透明，當(dāng)溫度升高到37℃后，DF2蛋白溶液變得渾濁，當(dāng)溫度再次降低到4攝氏度后，溶液又變回澄清的狀態(tài)，作者進(jìn)一步使用不同的方法證實(shí)了DF2的這一現(xiàn)象為LLPS。同時(shí)也證明了在生理濃度下的DF2蛋白（約5uM）能夠發(fā)生相分離現(xiàn)象。
作者進(jìn)一步檢測(cè)m6A修飾是否會(huì)在體外調(diào)節(jié)DF2蛋白的相分離過程。作者發(fā)現(xiàn)，帶有10個(gè)m6A修飾的65nt長度的RNA能夠顯著促進(jìn)DF蛋白的相分離現(xiàn)象。因此，作者推測(cè)，可能是帶有m6A修飾的RNA作為骨架促進(jìn)了DF蛋白的內(nèi)在無序區(qū)發(fā)生相分離現(xiàn)象。作者進(jìn)一步在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)了DF2是否能夠發(fā)生相分離現(xiàn)象，作者發(fā)現(xiàn)，帶有NeonGreen標(biāo)簽的DF2蛋白在細(xì)胞內(nèi)確實(shí)能夠發(fā)生相分離現(xiàn)象。
DF2蛋白定位于細(xì)胞內(nèi)的RNA granule, P-body和Stress granule中。通常，在細(xì)胞未經(jīng)歷來自于環(huán)境的壓力的狀態(tài)下，DF2蛋白定位于細(xì)胞內(nèi)的P-body以及分散在細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)歷Heat shock刺激后，DF2蛋白會(huì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞內(nèi)的Stress Granule中去。基于此，作者推測(cè)，是否m6A介導(dǎo)的DF2蛋白的相分離現(xiàn)象會(huì)調(diào)節(jié)DF2蛋白以及m6A修飾的mRNA在細(xì)胞中的定位。
作者檢測(cè)是否m6A調(diào)控了這一過程，作者在小鼠胚胎干細(xì)胞中敲除了METTL14后，細(xì)胞內(nèi)的Stress Granule在經(jīng)歷Heat shock的情況下能夠正常形成，但是DF2蛋白在Stress Granule中的定位顯著減少（下圖）。另外，不能與m6A結(jié)合的DF2的突變體，在應(yīng)激狀態(tài)下也不能定位到stress granule中。Stress granule中的mRNA的m6A修飾顯著高于細(xì)胞內(nèi)的總mRNA上的m6A修飾。也就是說，DF2在細(xì)胞應(yīng)激時(shí)的stress granule的定位是依賴于其與m6A修飾的結(jié)合的，即DF2的細(xì)胞定位受到了mRNA m6A修飾的的調(diào)節(jié)。
基于以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者推測(cè)，這一受到m6A修飾調(diào)控的DF2的相分離現(xiàn)象，可能反過來調(diào)控了帶有m6A修飾的mRNA的穩(wěn)定性以及其翻譯效率。作者發(fā)現(xiàn)，mRNA的穩(wěn)定性并不受到此過程的調(diào)控。因此，作者使用Ribosome Profiling技術(shù)檢測(cè)了在WT以及Mettl14 KO細(xì)胞中的帶有m6A修飾的mRNA的翻譯效率。作者發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞沒有受到Heat shock等刺激的情況下，WT以及Mettl14 KO細(xì)胞中，mRNA的翻譯效率沒有顯著差異。但是在細(xì)胞受到Heat shock的情況下，Mettl14 KO細(xì)胞中的被m6A修飾的mRNA的翻譯效率受到了明顯的抑制。
基于以上的結(jié)果，作者發(fā)現(xiàn)了RNA的m6A修飾，特別是polymethylated mRNA能與多個(gè)DF2蛋白相互結(jié)合，顯著促進(jìn)DF protein的相分離現(xiàn)象，DF2的相分離反過來調(diào)控了polymethylated mRNA的翻譯效率，為m6A修飾對(duì)于細(xì)胞生物學(xué)過程的精細(xì)調(diào)控提供了全新的理論。
這篇Nature paper于1月17日投稿到Nature，6月13日接受，7月10日online發(fā)表，在7月7日，哈佛大學(xué)莊小威實(shí)驗(yàn)室在bioRxiv上online了一篇題為m6A-binding YTHDF proteins promote stress granule formation by modulating phase separation of stress granule proteins（https://www.biorxiv.org/content/10.1101/694455v1）的文章，也發(fā)現(xiàn)了m6A的修飾能夠促進(jìn)YTHDF的相分離（熱點(diǎn)領(lǐng)域的競(jìng)爭(zhēng)總是殘酷的）。這篇文章中，作者通過分析m6A修飾的RNA在細(xì)胞經(jīng)歷不同的stress條件下的亞細(xì)胞定位入手，開發(fā)了一種能夠特異性m6A染色的方法，發(fā)現(xiàn)了m6A修飾的mRNA在細(xì)胞受到氧化應(yīng)激的條件下會(huì)大量定位到Stress Granule中。作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)YTHDF對(duì)于氧化應(yīng)激下Stress Granule的形成非常重要，siRNA敲低YTHDF后，在氧化應(yīng)激下細(xì)胞的Stress Granule會(huì)顯著減少。有意思的是在Nature paper中，明確報(bào)道了在細(xì)胞Under Heat shock壓力下，METTL14的敲除不會(huì)影響Stress Granule的形成，在bioRxiv這篇文章中，抑制了YTHDF的與m6A的結(jié)合，會(huì)顯著降低Stress Granule的形成。也就是說，氧化應(yīng)激下形成的stress Granule與在熱應(yīng)激下形成的Stress Granule可能是不同的蛋白所觸發(fā)，精細(xì)的機(jī)制及其調(diào)控還需要進(jìn)一步的深入研究。
綜上，兩篇文章不同的角度出發(fā)，得出了相同的結(jié)論，即m6A的修飾可以促進(jìn)mRNA與其結(jié)合蛋白共同發(fā)生相分離的過程。但是Nature paper更注重是YTHDF本身通過其YTH結(jié)構(gòu)域與m6A修飾的mRNA結(jié)合，促進(jìn)其IDR區(qū)域發(fā)生相分離，并通過詳實(shí)的體外以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明確實(shí)是YTHDF蛋白本身發(fā)生相分離，并且找到了發(fā)生相分離所介導(dǎo)的生物學(xué)功能，而莊小威實(shí)驗(yàn)室文章并無直接的證據(jù)表明是YTHDF本身發(fā)生的相分離，但是同樣通過一些列的精細(xì)的實(shí)驗(yàn)，以及莊小威實(shí)驗(yàn)室的高效的Imaging技術(shù)揭示了YTHDF的兩個(gè)domain都對(duì)于m6A促進(jìn)的相分離過程的重要性，但是缺乏體外的結(jié)果以及功能實(shí)驗(yàn)。兩篇文章用的誘導(dǎo)細(xì)胞壓力的方式也存在一定的不同，可能也是導(dǎo)致有個(gè)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的差異的原因。莊小威實(shí)驗(yàn)室將充分利用了其實(shí)驗(yàn)室的imaging的優(yōu)勢(shì)，而Samie R. Jaffrey利用了精細(xì)的生化實(shí)驗(yàn)以及其在m6A修飾領(lǐng)域建立了高通量測(cè)序手段等優(yōu)勢(shì)都揭示了m6A能夠調(diào)控相分離現(xiàn)象。
原文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41586-019-1374-1
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/694455v1
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