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RNA病毒組與生物信息學(xué)分析

RNA Virome and Bioinformatics Analysis

張譽(yù)譯^{1, 3}，陳毅聰¹，魏小曼^{1, 3, 4}，崔杰^{1, 2, *}

¹中國(guó)科學(xué)院上海巴斯德研究所，中國(guó)科學(xué)院分子病毒與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院生物安全大科學(xué)研究中心，上海市，上海市；²青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋生物與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，青島市，山東??；³中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京市，北京市；⁴中國(guó)科學(xué)院病毒研究所，中國(guó)科學(xué)院生物安全大科學(xué)研究中心，武漢市，湖北省

^*通訊作者郵箱：jcui@ips.ac.cn

摘要：病毒組學(xué)是一門借助Meta-genomics或Meta-transcriptomics的手段，對(duì)樣品中所攜帶的所有病毒進(jìn)行系統(tǒng)性分析的學(xué)科。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的興起，以及其在病原生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，人們對(duì)于病毒組的認(rèn)識(shí)有了極大的拓展，其研究可以輔助預(yù)測(cè)病毒性傳染病、了解病毒的進(jìn)化和基因組的多樣性、探究病毒在宿主或地域間的跨物種傳播現(xiàn)象，是描繪病毒生態(tài)圈的理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)方法旨在從目標(biāo)樣品中提取核酸并進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序，從測(cè)序結(jié)果中挖掘新病毒信息，并做病毒組分析。

關(guān)鍵詞：病毒組，宏轉(zhuǎn)錄組，病毒進(jìn)化，跨物種傳播

研究背景

致病性病毒的感染，是公眾健康的巨大威脅，同時(shí)會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。然而，傳統(tǒng)的病毒學(xué)研究具有明顯的不足。一方面，從局部部位采集的樣品，不足以反映整體的病毒情況，我們僅能從單一的點(diǎn)出發(fā)，對(duì)有限種類的病毒開(kāi)展研究。另一方面，因?yàn)槿鄙俸线m的培養(yǎng)體系或動(dòng)物模型，病毒學(xué)的基礎(chǔ)研究困難重重。相比于其他疾病，以上這些不足極大地限制了我們對(duì)于病毒的研究，也使得病毒成為了當(dāng)下研究最為不足的生物實(shí)體。

“病毒組（Virome）”是近年來(lái)興起的一個(gè)新的組學(xué)概念，是指特定的生物個(gè)體、生物群體或生態(tài)環(huán)境中攜帶的所有病毒的集合，其包括DNA或RNA作為遺傳物質(zhì)的、已知或未知的、致病或非致病的、內(nèi)源或外源的全部病毒。得益于高通量測(cè)序技術(shù)（HTS）的蓬勃發(fā)展，及其在病原生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，病毒組的研究日益成熟并且一改傳統(tǒng)的病毒學(xué)研究模式。人們不需要再頗費(fèi)周章地尋找合適的病毒培養(yǎng)體系或模式動(dòng)物，直接將感興趣的樣品構(gòu)建成測(cè)序文庫(kù)（Library），通過(guò)宏基因組（Meta-genomics）或宏轉(zhuǎn)錄組（Meta-transcriptomics）的測(cè)序方法便可以檢測(cè)樣品中的絕大部分病毒，從最宏觀的視角剖析最微觀的世界(Shi et al., 2018; Zhang et al., 2018; Zhang et al., 2019)。

高通量測(cè)序技術(shù)，又稱“下一代測(cè)序技術(shù)（NGS）”，是對(duì)傳統(tǒng)的測(cè)序方法的革命性的變革，可以同時(shí)對(duì)高達(dá)數(shù)百萬(wàn)條的核酸分子進(jìn)行序列測(cè)定，使得測(cè)序通量提高了成千萬(wàn)倍，也使得單一物種的基因組或轉(zhuǎn)錄組測(cè)序變得簡(jiǎn)單、快捷和便宜。高通量測(cè)序技術(shù)引領(lǐng)了多個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)突破，有著廣泛的應(yīng)用。在病毒學(xué)研究當(dāng)中，基于高通量測(cè)序技術(shù)的病毒組研究成為了人們認(rèn)識(shí)病毒世界的強(qiáng)大工具。Zhang等人在他們的一篇評(píng)論中詳細(xì)地介紹了利用宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)手段來(lái)拓展病毒圈（Virosphere），相比于其他傳統(tǒng)方法（病毒培養(yǎng)、共有引物PCR）具有通量高、視角廣等不可比擬的優(yōu)勢(shì)(Zhang et al., 2018)。

2017年，ICTV宣布將通過(guò)宏基因組或宏轉(zhuǎn)錄組的方法發(fā)現(xiàn)的病毒加入正式的病毒學(xué)分類體系(Simmonds et al., 2017)。高通量技術(shù)賦予了病毒學(xué)研究新的生機(jī)，自此人們發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)新病毒的過(guò)程進(jìn)入了“快車道”。

材料與試劑

儀器設(shè)備

另需：工作站 (型號(hào)：DELL Precision T7920；系統(tǒng)：Ubuntu 20.04；CPU：Intel(R) Xeon(R) Gold 6140 CPU @ 2.30GHz，36核)，用于運(yùn)行相關(guān)命令；普通個(gè)人電腦，用于調(diào)用個(gè)人終端、以及訪問(wèn)網(wǎng)頁(yè)版軟件和下載序列。

軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)

實(shí)驗(yàn)步驟

一、樣品采集

1. 依據(jù)課題需要收集合適的動(dòng)物樣品，樣品應(yīng)盡量保證鮮活，或在低溫 (4 °C) 環(huán)境下妥善保存。樣品在進(jìn)行解剖前可以在適宜的人造環(huán)境中 (人造海水、生理鹽水等) 平衡24 h，以減少采樣環(huán)境中的雜質(zhì)污染對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響。對(duì)采集的樣品進(jìn)行真實(shí)、詳細(xì)的文字記錄，并配有圖片、視頻等。文字記錄內(nèi)容包括但不局限于物種的名稱 (物種的鑒定由生態(tài)學(xué)專業(yè)相關(guān)人員進(jìn)行)、采樣數(shù)量、采樣時(shí)間、采樣地點(diǎn)、形態(tài)描述等。

2. 在干凈的操作臺(tái)上對(duì)樣品進(jìn)行解剖，應(yīng)使用75 %的酒精棉球仔細(xì)擦拭操作臺(tái)面、解剖工具、容器等 (在處理不同物種的樣品間隙，也應(yīng)該重復(fù)此步驟)。在冰上對(duì)樣品進(jìn)行解剖，剖取臟器等可能富含病毒的組織，轉(zhuǎn)移至新的、裝有RNA穩(wěn)定和儲(chǔ)存溶液 (RNAlater? Stabilization Solution，Invitrogen公司，AM7020) 的容器內(nèi) (試劑應(yīng)至少?zèng)]過(guò)組織塊)，并做好樣品的標(biāo)注。同一物種的不同個(gè)體，以及同個(gè)個(gè)體的不同臟器都應(yīng)該分管儲(chǔ)存。每個(gè)個(gè)體另取少量的肌肉組織于干凈的EP管內(nèi)。所有的樣品凍存于-20 °C或-80 °C冰箱保存，按照RNA穩(wěn)定和儲(chǔ)存溶液的官方說(shuō)明，樣品RNA在37 °C條件下可以穩(wěn)定保存1天，25 °C條件下1周，4 °C條件下1月，-20 °C條件下無(wú)期限。

二、物種鑒定

1.所有樣品的肌肉組織從冰箱取出于室溫解凍，吸水紙上吸干多余水分，切取約20 mg的肌肉組織于新的EP管中。使用DNA提取試劑盒 (FastPure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit，Vazyme公司，DC102) 提取肌肉組織gDNA：

1.1對(duì)于1-20 mg的組織樣品，加入230 ul Buffer GA和20 ul Proteinase K試劑 (若樣品質(zhì)量大于20 mg，按比例擴(kuò)大試劑加入量) 于55 °C水浴進(jìn)行消化裂解。為了促進(jìn)消化，組織塊應(yīng)盡量剪碎，或?qū)M織進(jìn)行勻漿。

1.2組織徹底消化后，加入10 ul RNase Solution至消化液中，37 °C水浴60 min。

1.3室溫，12000 x g離心3 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的1.5 ml EP管內(nèi)。

1.4加入250 ul Buffer GB至消化液中，渦旋混勻20 s，70 °C水浴10 min。

1.5加入250 ul無(wú)水乙醇至消化液中，渦旋混勻20 s。

1.6將gDNA Columns吸附柱置于2 ml的收集管中，將上一步所得的混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，室溫，12000 x g離心1 min。

1.7棄濾液，將吸附柱置于收集管中，加入500 ul Washing Buffer A至吸附柱中，輕柔顛倒吸附柱3次，室溫，12000 x g離心1 min。

1.8棄濾液，將吸附柱置于收集管中，加入650 ul Washing Buffer B至吸附柱中，輕柔顛倒吸附柱3次，室溫，12000 x g離心1 min。此步驟重復(fù)一次。

1.9棄濾液，將吸附柱置于收集管中，室溫，12000 x g離心2 min。

1.10將吸附柱置于新的1.5 ml離心管，加入30 ul預(yù)熱至70 °C的Elution Buffer至吸附柱的膜中央，室溫放置3 min，室溫，12000 x g離心1 min。

1.11將得到的濾液重新吸取并加入到吸附柱的膜中央，室溫放置3 min，室溫，12000 x g離心1 min。

2.測(cè)量DNA濃度并評(píng)價(jià)其質(zhì)量，保存于-20 °C冰箱中備用。

3.對(duì)樣品的細(xì)胞色素c氧化酶I基因 (COI基因) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增和鑒定，使用引物L(fēng)CO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’和HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’ (Folmer et al., 1994)。PCR體系使用高保真酶 (Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，Vazyme公司，P505)。25 ul的反應(yīng)體系中含有2X Phanta Max Buffer 12.5 ul，dNTP Mix (10 mM each) 0.5 ul，上游引物L(fēng)CO1490和下游引物HCO2198各1 ul，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5 ul，上一步中抽提的gDNA 100 ng，用ddH2O補(bǔ)足體積。PCR反應(yīng)條件：95 °C預(yù)變形3 min，35個(gè)循環(huán)的反應(yīng) (95 °C 15 s，54 °C 15 s，72 °C 1 min)，72 °C徹底延伸5 min。PCR產(chǎn)物取5 ul，使用2 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)在700 bp處有清晰可見(jiàn)的單一條帶。對(duì)此條帶進(jìn)行回收，送測(cè)序公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。返回的結(jié)果使用NCBI Blastn進(jìn)行驗(yàn)證，檢查物種信息是否正確。

三、文庫(kù)構(gòu)建

1.用于建庫(kù)的組織樣品 (浸泡于RNA穩(wěn)定和儲(chǔ)存溶液中)，從冰箱取出，于冰上融化，將組織取出并用吸水紙吸干表面液體。使用RNA提取試劑盒 (FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit，Vazyme公司，RC101) 提取組織總RNA (提取過(guò)程注意防范RNase污染)：

1.1對(duì)于10-20 mg的組織樣品，加入500 ul Buffer RL1 (已加入β-巰基乙醇或4 M DTT至終濃度為1 %，現(xiàn)配現(xiàn)用) (若樣品質(zhì)量大于20 mg，按比例擴(kuò)大試劑加入量)，使用電動(dòng)勻漿器將組織徹底研磨均勻。

1.2勻漿轉(zhuǎn)移到gDNA-Filter Columns中 (放入收集管內(nèi))，室溫，13400 x g離心2 min。離心后棄掉gDNA-Filter Columns，保留收集管內(nèi)上清液。

1.3向收集管內(nèi)加入1.6倍體積的Buffer RL2，并輕柔混勻?；旌弦恨D(zhuǎn)移至RNAPure Columns中 (放入收集管內(nèi))，室溫，13400 x g離心1 min。

1.4棄濾液，將吸附柱置于收集管中，加入500 ul Buffer RW1至吸附柱中，室溫，13400 x g離心1 min。

1.5棄濾液，將吸附柱置于收集管中，加入700 ul Buffer RW2至吸附柱中，室溫，13400 x g離心1 min。

1.6棄濾液，將吸附柱置于收集管中，向膜中央加入70 ul的DNase I反應(yīng)工作液(65 ul Buffer RDD和5 ul DNase I)，室溫靜置30 min。

1.7將吸附柱置于收集管中，加入500 ul Buffer RW1至吸附柱中，室溫，13400 x g離心1 min。

1.8棄濾液，將吸附柱置于收集管中，加入700 ul Buffer RW2至吸附柱中，室溫，13400 x g離心1 min。此步驟重復(fù)一次。

1.9棄濾液，將吸附柱置于收集管中，室溫，13400 x g離心2 min。

1.10將吸附柱置于新的1.5 ml離心管，加入50 ul的RNase-free ddH2O至吸附柱的膜中央，室溫放置2 min，室溫，13400 x g離心1 min。

1.11將得到的濾液重新吸取并加入到吸附柱的膜中央，室溫放置2 min，室溫，13400 x g離心1 min。

1.12使用微量紫外分光光度計(jì)（Nanodrop）檢測(cè)RNA的濃度和純度，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。

1.13依據(jù)初步檢測(cè)的濃度，使用RNase-free ddH2O將RNA溶液調(diào)整至10 pg/ul - 100 ng/ul之間。使用Qubit試劑（Equalbit RNA HS Assay Kit，Vazyme公司，EQ211）進(jìn)行精確的濃度測(cè)定。Qubit Buffer和Qubit Reagent按照200:1的比例配置成Qubit Working Solution。取199 ul的Qubit Working Solution和1 ul稀釋好的RNA樣品于干凈的0.5 ml薄壁離心管中，另取190 ul的Qubit Working Solution和10 ul的標(biāo)準(zhǔn)品于干凈的0.5 ml的薄壁離心管中。所有樣品于室溫避光孵育2 min，使用Qubit儀器（Qubit 3或4）進(jìn)行檢測(cè)。

1.14下游的建庫(kù)實(shí)驗(yàn)要求較高質(zhì)量的RNA，應(yīng)保證RNA的濃度高于10 ng/ul且總量不低于10 ng，OD260/OD280比值介于1.8-2.1之間，OD260/OD230比值介于2-2.5之間，電泳條帶可以看到清晰、明亮的兩條條帶。若RNA質(zhì)量不合格，應(yīng)重新提取RNA。將RNA溶液保存于-80 °C冰箱中備用，并盡快開(kāi)展下游的文庫(kù)構(gòu)建實(shí)驗(yàn)。

2.用于測(cè)序的總RNA樣品，從冰箱取出，于冰上融化。使用RNA建庫(kù)試劑盒(VAHTS Universal V6 RNA-seq Library Prep Kit for Illumina，Vazyme公司，NR604)、rRNA去除試劑盒 (Ribo-off ? rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)，Vazyme公司，N406)、rRNA去除試劑盒 (Ribo-off ? rRNA Depletion Kit (Bacteria)，Vazyme公司，N407)、高通量測(cè)序接頭試劑盒 (VAHTS RNA Multiplex Oligos Set1- Set2 for Illumina，Vazyme公司，N323/N324) 進(jìn)行建庫(kù)實(shí)驗(yàn) (Shi et al., 2016; Zhang et al., 2018)：

2.1取1 ug總RNA于微量離心管中，并用Nuclease-free H2O稀釋至10 ul，冰上放置備用。

2.2向管中加入1 ul rRNA Probe (Human/Mouse/Rat)，1 ul rRNA Probe (Bacteria)，3 ul Probe Buffer至總體積15 ul，用移液槍吹打混勻。于PCR儀中進(jìn)行探針雜交反應(yīng)，反應(yīng)條件：105 °C熱蓋，95 °C 2 min，95-22 °C 0.1 °C/s，22 °C 5 min。注：因?yàn)槭忻嬖谑鄣膔RNA去除試劑盒僅有針對(duì)宿主為人/小鼠/大鼠、細(xì)菌和植物三種。在病毒組研究的實(shí)踐過(guò)程中，聯(lián)合使用人/小鼠/大鼠以及細(xì)菌來(lái)源的rRNA去除試劑盒，可以取得較為理想的清楚效果。然而在用于非哺乳或非細(xì)菌宿主類型的樣品處理時(shí)，rRNA的清除效率可能會(huì)有所降低。若想檢測(cè)rRNA的去除效率，請(qǐng)?jiān)O(shè)置對(duì)照組，并在此處使用2 ul的RNase-free ddH2O替代rRNA Probe (Human/Mouse/Rat)和rRNA Probe (Bacteria)。

2.3向管中加入4 ul RNase H Buffer，1 ul RNase H至總體積20 ul，用移液槍吹打混勻。于PCR儀中進(jìn)行RNase H消化反應(yīng)，反應(yīng)條件：37 °C 30 min，4 °C Hold。

2.4向管中加入29 ul DNase I Buffer，1 ul DNase I至總體積50 ul，用移液槍吹打混勻。于PCR儀中進(jìn)行DNase I消化反應(yīng)，反應(yīng)條件：37 °C 30 min，4 °C Hold。

2.5渦旋振蕩混勻VAHTS RNA Clean Beads，吸取110 ul至上一步的樣品中，用移液槍吹打混勻，冰上靜置15 min，使RNA結(jié)合到磁珠上。

2.6將樣品置于磁力架上5 min，待溶液澄清后，小心移除上清液，隨即加入200 ul 用Nuclease-free H2O配置的80 %乙醇 (現(xiàn)用現(xiàn)配)，漂洗磁珠 (此步驟保持樣品在磁力架上)。此步驟重復(fù)一次。

2.7保持樣品始終處于磁力架中，在室溫下開(kāi)蓋干燥磁珠10 min。

2.8將樣品從磁力架上取出，加入18.5 ul Frag/Prime Buffer，用移液槍吹打混勻，室溫靜置2 min，在磁力架上靜置5 min，待溶液澄清后，小心吸取16 ul上清至新的微量離心管中。于PCR儀中進(jìn)行片段化反應(yīng)，反應(yīng)條件：94 °C 5 min，4 °C Hold。注：若想檢測(cè)rRNA的去除效率，請(qǐng)?jiān)诖颂幱?1 ul的RNase-free ddH2O替代Frag/Prime Buffer進(jìn)行洗脫，并吸取18ul的上清至新的微量離心管中。后續(xù)步驟見(jiàn)步驟3。

2.9將Actinomycin D溶液從5 mg/ml稀釋至0.12 mg/ml：向48.8 ul的Nuclease-free H2O中加入1.2 ul Actinomycin D (5 mg/ml) 至總體積50 ul，混勻備用。

2.10向片段化反應(yīng)后的樣品中加入1 ul Actinomycin D (0.12 mg/ml)，6 ul 1st Strand Buffer 2，1st Strand Enzyme Mix 2至總體積25 ul，用移液槍吹打混勻。于PCR儀中進(jìn)行第一鏈cDNA合成反應(yīng)，反應(yīng)條件：105 °C熱蓋，25 °C 10 min，42 °C 15 min，70 °C 15 min，4 °C Hold。

2.11向上一步的反應(yīng)液中加入25 ul 2nd Strand Buffer 2 (with dUTP)，15 ul 2nd Strand Enzyme Super Mix至總體積65 ul，用移液槍吹打混勻。于PCR儀中進(jìn)行第二鏈cDNA合成反應(yīng)，反應(yīng)條件：105 °C熱蓋，16 °C 30 min，65 °C 15 min，4 °C Hold。

2.12向上一步的反應(yīng)液中加入5 ul RNA Adapter，25 ul Rapid Ligation Buffer 3，5 ul Rapid DNA Ligase 2，加入Nuclease-free H2O將體積補(bǔ)至100 ul，用移液槍吹打混勻。于PCR儀中進(jìn)行接頭連接反應(yīng)，反應(yīng)條件：105 °C熱蓋，20 °C 15 min，4 °C Hold。

2.13渦旋振蕩混勻VAHTS DNA Clean Beads (磁珠及所用Buffer都應(yīng)提前從冰箱取出，靜置使其平衡至室溫)，吸取45 ul至上一步的樣品中，用移液槍吹打混勻，室溫靜置10 min，使DNA結(jié)合到磁珠上。

2.14將樣品置于磁力架上5 min，待溶液澄清后，小心移除上清液，隨即加入200 ul 用80 %乙醇 (現(xiàn)用現(xiàn)配)，漂洗磁珠 (此步驟保持樣品在磁力架上)。此步驟重復(fù)一次。

2.15保持樣品始終處于磁力架中，在室溫下開(kāi)蓋干燥磁珠10 min。

2.16將樣品從磁力架上取出，加入102.5 ul Nuclease-free H2O，用移液槍吹打混勻，室溫靜置2 min，在磁力架上靜置5 min，待溶液澄清后，小心吸取100 ul上清至新的微量離心管中。

2.17渦旋振蕩混勻VAHTS DNA Clean Beads (磁珠及所用Buffer都應(yīng)提前從冰箱取出，靜置使其平衡至室溫)，吸取70 ul至上一步的樣品中，用移液槍吹打混勻，室溫靜置10 min，使DNA結(jié)合到磁珠上。

2.18將樣品置于磁力架上5 min，待溶液澄清后，吸取155 ul上清液于新的微量離心管中，再次加入10 ul VAHTS DNA Clean Beads，用移液槍吹打混勻，室溫靜置10 min，使DNA結(jié)合到磁珠上。

2.19將樣品置于磁力架上5 min，待溶液澄清后，小心移除上清液，隨即加入200 ul 用80 %乙醇 (現(xiàn)用現(xiàn)配)，室溫孵育30 s漂洗磁珠 (此步驟保持樣品在磁力架上)，小心移除上清。漂洗的步驟重復(fù)一次。

2.20保持樣品始終處于磁力架中，在室溫下開(kāi)蓋干燥磁珠10 min。

2.21將樣品從磁力架上取出，加入21.5 ul Nuclease-free H2O，用移液槍吹打混勻，室溫靜置2 min，置于磁力架上5 min，待溶液澄清后，小心吸取19 ul上清至新的微量離心管中。

2.22向上一步的樣品中加入2.5 ul i5 PCR Primer，2.5 ul i7 PCR Primer，25 ul VAHTS HiFi Amplification Mix，1 ul Heat-labile UDG，至總體積50 ul，用移液槍吹打混勻。于PCR儀中進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件：105 °C熱蓋，37 °C 10 min，98 °C預(yù)變形30 s，13個(gè)循環(huán)的反應(yīng) (98 °C 10 s，60 °C 30 s，72 °C 30 s），72 °C徹底延伸5 min，4 °C Hold。

2.23渦旋振蕩混勻VAHTS DNA Clean Beads (磁珠及所用Buffer都應(yīng)提前從冰箱取出，靜置使其平衡至室溫)，吸取45 ul至上一步的樣品中，用移液槍吹打混勻，室溫靜置10 min，使DNA結(jié)合到磁珠上。

2.24將樣品置于磁力架上5 min，待溶液澄清后，小心移除上清液，隨即加入200 ul 用80 %乙醇 (現(xiàn)用現(xiàn)配)，室溫孵育30 s漂洗磁珠 (此步驟保持樣品在磁力架上)，小心移除上清。漂洗的步驟重復(fù)一次。

2.25保持樣品始終處于磁力架中，在室溫下開(kāi)蓋干燥磁珠10 min。

2.26將樣品從磁力架上取出，加入25 ul Nuclease-free H2O，用移液槍吹打混勻，室溫靜置2 min，置于磁力架上5 min，待溶液澄清后，小心吸取22.5 ul上清至新的離心管中。

3.rRNA殘留量檢測(cè)：

3.118 ul的RNA洗脫液（實(shí)驗(yàn)組為進(jìn)行了rRNA去除的，對(duì)照組為未進(jìn)行rRNA去除的）使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)，Vazyme公司，R323）。向RNA洗脫液中加入6 ul的4 X gDNA wiper Mix，于PCR儀內(nèi)42°C孵育2min。加入6ul的5 X HiScript III qRT SuperMix，于PCR儀內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件：37°C 15 min，85°C 5 s。

3.2使用熒光定量PCR（ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，Vazyme公司，Q711）進(jìn)行檢測(cè)。取2.5 ul的cDNA，加入12.5 ul的2 X ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，加入2.5 ul的上游引物和2.5 ul的下游引物（引物依據(jù)具體的宿主類型進(jìn)行設(shè)計(jì)，并針對(duì)持家基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)作為對(duì)照），用ddH2O補(bǔ)足25 ul。使用熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)條件：95°C 30 s，40循環(huán)的95°C 10s，60°C 30s。

3.3對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算rRNA的殘留量或清除效率。

4.文庫(kù)質(zhì)檢：

4.1使用微量紫外分光光度計(jì)（Nanodrop）檢測(cè)文庫(kù)的濃度和純度檢測(cè)，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)文庫(kù)的片段大小分布。

4.2依據(jù)初步檢測(cè)的濃度，使用RNase-free ddH2O將文庫(kù)濃度調(diào)整至10 pg/ul - 100 ng/ul之間。使用Qubit試劑（Equalbit 1 × dsDNA HS Assay Kit，Vazyme公司，EQ121）進(jìn)行精確的濃度測(cè)定。取199 ul的Qubit Working Solution和1 ul稀釋好的文庫(kù)樣品于干凈的0.5 ml的薄壁離心管中，另取190 ul的Qubit Working Solution和10 ul的標(biāo)準(zhǔn)品于干凈的0.5 ml的薄壁離心管中。所有樣品于室溫避光孵育2 min，使用Qubit儀器（Qubit 3或4）進(jìn)行檢測(cè)。

4.3取1 ul的文庫(kù)樣品加入5 ul的Marker，加入制備好的芯片中（高靈敏度 DNA 試劑盒，安捷倫公司，5067-4626），使用安捷倫2100生物分析儀進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估文庫(kù)的質(zhì)量。并用Agilent 2100進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)量的評(píng)價(jià)。質(zhì)檢合格的樣品，送公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

4.4為保證測(cè)序質(zhì)量，文庫(kù)濃度應(yīng)大于10 ng/ul，電泳條帶應(yīng)為350-650 bp間較窄的彌散條帶，2100的分析結(jié)果應(yīng)顯示基線平整，單一窄峰，無(wú)雜峰，無(wú)接頭或引物二聚體。

5.高通量測(cè)序：樣品送測(cè)序公司，進(jìn)行高通量測(cè)序。

四、RNA病毒的鑒定和分析流程圖：

本實(shí)驗(yàn)方案使用的RNA病毒的鑒定和分析流程，見(jiàn)下圖：

五、數(shù)據(jù)預(yù)處理

1.數(shù)據(jù)獲取：從測(cè)序公司獲取原始數(shù)據(jù)（文件格式為sample.fastq.gz），對(duì)照送樣信息檢查文件是否缺漏。將文件上傳至服務(wù)器home目錄下data文件夾內(nèi)，使用gzip命令進(jìn)行解壓。

2.數(shù)據(jù)質(zhì)檢：使用FastQC軟件對(duì)每個(gè)文庫(kù)的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)檢，使用命令“fastqc -o fastqc -f fastq *.fastq”。執(zhí)行此命令前切換至存放fastq文件的路徑，并提前創(chuàng)建用于存放質(zhì)檢報(bào)告的文件夾fastqc。

3.數(shù)據(jù)修剪：使用Trimmomatic軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行修剪和接頭去除，使用命令“trimmomatic PE -threads 4 -phred33 sample_R1.fastq sample_R2.fastq sample-1P.fq sample-1U.fq sample-2P.fq sample-2U.fq ILLUMINACLIP:adapter.fa:2:30:10:1:true LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:20 MINLEN:50”。其中，測(cè)序模式選擇雙端測(cè)序模式，輸入R1和R2兩個(gè)測(cè)序結(jié)果文件，輸出1P、1U、2P、2U四個(gè)結(jié)果文件，使用adapter.fa文件中記錄的adapter信息進(jìn)行接頭去除，從reads的頭部和末尾分別切除質(zhì)量值低于3的堿基，從reads的頭部開(kāi)始進(jìn)行長(zhǎng)度為4的滑窗檢查并去除平均質(zhì)量低于20的滑窗內(nèi)的所有堿基，去除修剪后長(zhǎng)度低于50 nt的reads。

4.從頭拼接（如從公司接收的數(shù)據(jù)為clean data，可以直接進(jìn)行此步驟）：使用Trinity軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭拼接，使用命令“Trinity --seqType fq --max_memory 50G --left sample-1P.fq --right sample-2P.fq --CPU 12”。其中數(shù)據(jù)類型選擇fastq格式，輸入經(jīng)過(guò)修剪的1P、2P文件，依據(jù)工作站性能選擇合適的內(nèi)存量和線程數(shù)。需要注意的是，Trinity的輸出文件夾必須包含有“trinity”字段。

六、RNA病毒鑒定與分析

1.序列準(zhǔn)備：將樣品名稱添加到各條contig名稱的前面，用“__”分隔，并刪除長(zhǎng)度和位置信息，確保contig名稱內(nèi)沒(méi)有空格和特殊字符。使用cat命令，將所有樣品的contig文件合并成一個(gè)文件。

2.使用DIAMOND軟件，對(duì)來(lái)自于病毒的contigs序列進(jìn)行富集：

2.1從NCBI FTP服務(wù)器下載數(shù)據(jù)庫(kù)序列以及物種對(duì)應(yīng)信息：nr.fasta，prot. accession2taxid.gz，nodes.dmp。

2.2構(gòu)建nr數(shù)據(jù)庫(kù)：diamond makedb --in nr.fasta --db nr --taxonmap prot. accession2taxid.gz --taxonnodes nodes.dmp。

2.3Blastx：diamond blastx --query [input.fasta] --out [output.txt] --db nr --taxonlist 10239 --ev alue 1E-5。

2.4提取有hit的contigs序列至新的fasta文件中，進(jìn)行后續(xù)分析。

3.構(gòu)建filter_list，使用DIAMOND軟件，對(duì)上一步的contigs序列進(jìn)行過(guò)濾：

3.1從Virus-Host database里，整理出宿主為植物、真菌、細(xì)菌、古菌的病毒以及逆轉(zhuǎn)錄病毒，收集taxonid，作為filter_list。

3.2Blastx：diamond blastx --query [input.fasta] --out [output.txt] --db nr --taxonlist [filter_list] --ev alue 1E-10。

3.3提取沒(méi)有hit的contigs序列至新的fasta文件中，進(jìn)行后續(xù)分析。

4.使用DIAMOND軟件，對(duì)RNA病毒進(jìn)行發(fā)掘：

4.1從NCBI下載所有的RdRp的蛋白序列 (RefSeq)，RdRp_pr.fasta。

4.2構(gòu)建RdRp數(shù)據(jù)庫(kù)：diamond makedb --in RdRp.fasta --db RdRp

4.3Blastx：diamond blastx --query [input.fasta] --out [output.txt] --db RdRp --ev alue 1E-5。

4.4提取有hit的contigs序列至新的fasta文件。

5.使用DIAMOND軟件，對(duì)上一步的contigs序列進(jìn)行進(jìn)一步的過(guò)濾：

5.1Blastx：diamond blastx --query [input.fasta] --out [output.txt] --db nr --ev alue 1E-5。

5.2提取有hit且top hit為病毒蛋白的contigs序列至新的fasta文件，舍棄有hit但top hit不為病毒蛋白的假陽(yáng)性序列。

6.使用ORFfinder軟件，對(duì)上一步的contigs序列進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)，并將ORF的氨基酸序列保存至新的fasta文件中：ORFfinder -in [input_nu.fasta] -out [output_pr.fasta] -s 0 -ml 150 -n true。

7.使用DIAMOND軟件，對(duì)上一步的ORF序列進(jìn)行過(guò)濾：

7.1Blastp：diamond blastp --query [input.fasta] --out [output.txt] --db nr --ev alue 1E-5。

7.2提取有hit且top hit為病毒蛋白的ORF序列至新的fasta文件，舍棄有hit但top hit不為病毒蛋白的假陽(yáng)性序列。

8.使用網(wǎng)頁(yè)版Batch CD-search，對(duì)上一步的ORF序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)，將具有RdRp結(jié)構(gòu)域的ORF序列提取至新的fasta文件里。這些包含有RdRp結(jié)構(gòu)域的序列，即RNA病毒序列，進(jìn)行后續(xù)的分析。

9.從原始的contigs文件中提取RNA病毒對(duì)應(yīng)的核酸序列，針對(duì)這些序列分別設(shè)計(jì)引物。將抽提的總進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后使用高保真酶對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶，并切取對(duì)應(yīng)的條帶送公司進(jìn)行一代測(cè)序，用于對(duì)高通量測(cè)序和從頭拼接的驗(yàn)證。對(duì)于擴(kuò)增失敗或者測(cè)序結(jié)果不符合的序列，應(yīng)予以剔除，不再進(jìn)行后續(xù)的分析。

10.基因組可視化：依據(jù)每條contig的長(zhǎng)度、開(kāi)放閱讀框、保守結(jié)構(gòu)域，使用IBS軟件的Nucleotide模式進(jìn)行繪圖。作圖完成后保存工程文件，輸出PDF文件。使用AI軟件進(jìn)行進(jìn)一步的調(diào)整和美化。

11.使用NCBI Blast+軟件，利用ICTV的數(shù)據(jù)，對(duì)RNA病毒進(jìn)行物種信息的確定：

11.1從ICTV網(wǎng)站下載最新公平的病毒信息表，下載所有的病毒核酸序列，ICTV_virus.fasta。

11.2構(gòu)建病毒數(shù)據(jù)庫(kù)：makeblastdb -in ICTV_virus.fasta -out ICTV_virus -dbtype nucl。

11.3tblastn：tblastn -query [input.fasta (RNA病毒的ORF序列)] -out [output.txt] -db ICTV_virus -evalue 1E-5 -qcov_hsp_perc 40。

11.4提取每條RNA病毒序列的top hit的病毒信息，并在ICTV信息表中查找其物種信息，作為該RNA病毒的物種信息。

12.使用DIAMOND、TBtools、usearch、Mafft、trimAL、iqtree等軟件，對(duì)RNA病毒按照病毒種類，進(jìn)行進(jìn)化學(xué)地位的分析：

12.1Blastp：diamond blastp --query [input.fasta] --out [output.txt] --db nr --ev alue 1E-5。提取每個(gè)病毒前50個(gè)hit的accession號(hào)至ref_list。

12.2從ICTV的病毒信息表中提取該種類病毒的所有參考序列的accession號(hào) (核酸序列)，依據(jù)其注釋信息提取其RdRp區(qū)域的蛋白序列，并將其accession號(hào)合并存至ref_list中。

12.3對(duì)于ref_list當(dāng)中記錄的所有accession號(hào)進(jìn)行去重，使用TBtools軟件下載所有的參考序列。

12.4使用usearch軟件對(duì)參考序列進(jìn)行85 %一致性的去重：usearch -cluster_fast [input.fasta] -id 0.85 -centroids [output.fasta]。

12.5將該種類新發(fā)現(xiàn)的RNA病毒的ORF序列和參考序列合并，使用Mafft軟件進(jìn)行比對(duì)：mafft --auto --reorder [input.fasta] > [output.fasta]。

12.6使用trimAL軟件對(duì)序列進(jìn)行修建：trimal -in [input.fasta] -out [output.fasta] -gappyout。

12.7使用iqtree對(duì)修建后的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的構(gòu)建：iqtree -s [input.fasta] -m TEST -alrt 1000。

13.使用Mafft、Mega、Cytoscape軟件，對(duì)RNA病毒進(jìn)行跨物種、跨地域傳播的分析：

13.1序列準(zhǔn)備：廣泛閱讀文獻(xiàn)，收集文獻(xiàn)中報(bào)道的，記錄有詳細(xì)的病毒宿主、樣品采集地點(diǎn)信息的RNA病毒序列。

13.2整理本課題分析中新發(fā)現(xiàn)的RNA病毒的核酸序列，對(duì)照樣品采樣表整理病毒宿主、樣品采集地點(diǎn)信息。依據(jù)病毒宿主和樣品采集信息對(duì)RNA病毒進(jìn)行分類。將所有的RNA病毒的核酸序列整合到一個(gè)fasta文件內(nèi)。

13.3序列比對(duì)：將RNA病毒序列和參考序列合并至一個(gè)fasta文件內(nèi)，使用Mafft軟件進(jìn)行比對(duì)：mafft --auto --reorder [input.fasta] > [output.fasta]。

13.4比對(duì)后的序列文件用Mega打開(kāi)并計(jì)算遺傳距離 (Model/Method使用p-distance，Gaps/Missing Data Treatment使用Pairwise deletion)，將結(jié)果導(dǎo)出至Excel文件。依據(jù)分組情況，進(jìn)行組間比較，分別提取兩個(gè)組內(nèi)病毒之間的遺傳距離，將遺傳距離小于0.3的數(shù)據(jù)輸出至新的Excel表格中。

13.5網(wǎng)絡(luò)作圖：使用Cytoscape軟件作圖，excel表格中的第一列和第二列作為節(jié)點(diǎn)信息，第三列作為節(jié)點(diǎn)間的連線信息。使用兩個(gè)地點(diǎn)間的跨物種傳播事件數(shù)為每條連線的寬度進(jìn)行加權(quán)；每個(gè)地點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的RNA病毒數(shù)目，取10為底的對(duì)數(shù)，為每個(gè)節(jié)點(diǎn)的大小進(jìn)行加權(quán)。調(diào)整網(wǎng)絡(luò)圖的形狀、顏色等，完成后保存工程文件，輸出PDF文件。使用AI軟件進(jìn)行進(jìn)一步的調(diào)整和美化。

致謝

1.本實(shí)驗(yàn)的經(jīng)費(fèi)來(lái)源于國(guó)家自然科學(xué)基金 (31970176)，中國(guó)科學(xué)院“百人計(jì)劃”以及中科院分子病毒學(xué)與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金（KLMVI-OP-201901），廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金（FEEL-2019-6）。

2.本實(shí)驗(yàn)方法改編自Shi等人于2016和2018年發(fā)表在Nature上的兩篇文章。

參考文獻(xiàn)

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2.Shi, M., Lin, X. D., Tian, J. H., Chen, L. J., Chen, X., Li, C. X., Qin, X. C., Li, J., Cao, J. P., Eden, J. S., Buchmann, J., Wang, W., Xu, J., Holmes, E. C. and Zhang, Y. Z. (2016). Redefining the invertebrate RNA virosphere. Nature 540(7634): 539-543.

3.Shi, M., Zhang, Y. Z. and Holmes, E. C. (2018). Meta-transcriptomics and the evolutionary biology of RNA viruses. Virus Res 243: 83-90. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29111455

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6.Zhang, Y. Z., Shi, M. and Holmes, E. C. (2018). Using Metagenomics to Characterize an Expanding Virosphere. Cell 172(6): 1168-1172.