科學(xué)問題：
1.在過去的十年里，免疫治療顯著的改善了癌癥治療的狀況，但對于不同的腫瘤病人或腫瘤類型，它的效果是不一致的。突變數(shù)量、腫瘤浸潤的淋巴細胞和藥物靶點表達等若干因素，雖然與抗CTLA4和抗PD-1病人的治療具有相關(guān)性，但它們不穩(wěn)定無法作為診斷標志物。因此，免疫治療的改進和對治療反應(yīng)穩(wěn)定預(yù)測的生物標志物的發(fā)現(xiàn)顯得尤為重要。
2.肝癌是全世界癌癥相關(guān)的死亡中主要源頭，慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是我國肝癌的主要原因。但是目前治療手段有限且免疫治療缺乏臨床成功。
3. 參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的免疫細胞類型多樣且異質(zhì)性很強，只有對浸潤淋巴細胞進行單細胞測序分析才能更好的理解復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境，真正獲得系統(tǒng)詳盡的腫瘤免疫圖譜，從而有助于腫瘤免疫療法的發(fā)展及有效靶點和生物標志物的發(fā)現(xiàn)。
研究策略：
對六位未進行治療的肝癌病人的腫瘤樣本，進行大量的外顯子和RNA序列分析，以便獲得基本表達特征。對來自外周血液、鄰近正常組織和腫瘤組織的>5000個T細胞進行單細胞RNA測序分析，同時獲得完整的TCR序列和轉(zhuǎn)錄組。通過生物信息學(xué)的算法和思想，基于分子的類型和功能對T細胞群進行亞型分類、發(fā)育軌跡分析以及各組織區(qū)域中相應(yīng)亞群的T細胞數(shù)量分布，闡述腫瘤組織中T細胞的富集類型和來源。
研究結(jié)果：
在肝癌病人處，采集血液和肝組織（包括鄰近的正常肝組織和肝癌組織），分別進行DNA/RNA提取和單細胞分離，獲得大量的DNA/RNA序列和單細胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果，從而可以繪制基因表達圖譜和TCR序列圖譜。同一位置、同一細胞類型的細胞聚類表明，同一患者不同淋巴細胞群具有不同的性質(zhì)和內(nèi)在結(jié)構(gòu)。
為了揭示整體T細胞群體的內(nèi)在結(jié)構(gòu)和潛在的功能亞型，作者使用t-SNE的方法對所有T細胞進行無監(jiān)督聚類。共出現(xiàn)11個穩(wěn)定的細胞簇，其中CD8+簇5個，CD4+細胞簇6個。通過組織間不同簇中細胞百分比對比，發(fā)現(xiàn)CTLA4high的Tregs和耗竭的CD8細胞會在HCC中優(yōu)先富集。
因為被富集的兩類T細胞表達的共同抑制受體，如PDCD1和TIGIT，可以作為免疫治療的靶點，作者有進一步分析了這些細胞類型，鑒定出腫瘤浸潤Tregs中特異性表達的401個基因，這些HCC特異的Tregs基因與之前針對黑色素瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌的研究發(fā)現(xiàn)的基因有明顯重疊。在上述的3項研究中，共有33個共同的Tregs信號基因，作者從獲得數(shù)據(jù)中也鑒定出31個Tregs基因。之后，作者分析了浸潤腫瘤的衰竭CD8+T細胞，通過與未衰竭的腫瘤T細胞對比，得到了82個shuaijie 特異的基因。
LAYN編碼的layilin在肺和結(jié)腸腫瘤分離的Tregs中高表達，但對其功能特性還不了解。根據(jù)數(shù)據(jù)，作者發(fā)現(xiàn)LAYN在腫瘤Tregs(C8_CD4-CTLA4)和耗竭的TTC細胞(C4_CD8-LAYN)中均表現(xiàn)出高度特異性的表達模式，TCGA生存數(shù)據(jù)也表明，高表達的LAYN會減少預(yù)后病人的生存比率。經(jīng)過驗證，LAYN蛋白在Tregs和CD8+T細胞中可被誘導(dǎo)產(chǎn)生，其較高水平的表達對患者預(yù)后不良。
因為TCR經(jīng)常被用作識別T細胞祖先的獨特識別因子，作者利用5個HBV陽性肝癌患者的單細胞RNA-seq數(shù)據(jù)，通過TraCeR方法收集的全長TCR α鏈和β鏈的序列，用來追蹤單個T細胞的族系。作者一共檢測了94%的T細胞(3,792/4,032)的全部TCR序列，它們都至少有1個配對的生產(chǎn)性TCR α-β鏈可用于T細胞克隆分析，結(jié)果表明TCR序列信息可以與T細胞的不同狀態(tài)對應(yīng)，并支持HCC中CD8+T細胞和Tregs潛在的克隆擴增的觀點。
完整的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及T細胞的TCR序列能夠深入了解腫瘤浸潤T細胞的功能狀態(tài)以及它們之間的關(guān)系。作者使用Monocle2算法使CD8+T細胞或CD4+T輔助細胞沿偽時間分布，刻畫它們的發(fā)育軌跡。基于軌跡和TCR分析，作者推斷耗竭的CD4和CD8 T細胞與各自發(fā)育中的表達GZMA基因的 T細胞亞群的關(guān)系比與效應(yīng)T細胞亞群的關(guān)系更緊密相關(guān)。
腫瘤微環(huán)境中的T細胞易于耗竭或被Tregs（被調(diào)節(jié)性T細胞）抑制，從而阻止CD8細胞引發(fā)T細胞介導(dǎo)的腫瘤細胞殺傷作用。另外，肝癌微環(huán)境中大量擴增克隆的Tregs也許也是抑制效應(yīng)CD8+ T細胞殺傷作用的原因。Tregs克隆富集現(xiàn)象表明，它們的TCRs可能識別肝癌抗原，這些Tregs克隆的擴增最有可能增強其免疫抑制功能，進一步限制了腫瘤浸潤T細胞的效應(yīng)功能。
研究結(jié)論：
該研究鑒定了肝癌組織中T細胞的11種亞細胞群，描繪了它們的發(fā)育軌跡。通過單細胞水平TCRs克隆分析可以推斷這些亞型細胞在腫瘤微環(huán)境中的活化狀態(tài)。證明了CCR8和LAYN是肝癌相關(guān)的標記基因，其中LAYN也與腫瘤浸潤的CD8+T細胞的衰竭和預(yù)后不良有關(guān)。在來自人類血液的CD8+T細胞中過表達LAYN會導(dǎo)致IFN-γ顯著減少。在亞群的發(fā)育軌跡中，C5_CD8-GZMK cluster位于效應(yīng)T細胞和衰竭T細胞之間，猜測它可能是作為一種過渡狀態(tài)。該研究也證明了GNLY+CD4效應(yīng)T細胞和CX3CR1+CD8細胞具有相同的基因表達特征，暗示著CD4也有細胞毒性功能。MAIT細胞雖然在乙肝病毒感染時為表現(xiàn)出活化狀態(tài)，但是它在肝臟抵御病原菌入侵的過程仍然有不容小覷的作用。研究過程中發(fā)現(xiàn)，MAIT細胞在肝癌組織中的含量明顯少于近旁正常肝臟組織，這可能和它殺傷腫瘤細胞的功能有關(guān)，低表達MAIT細胞中的SLC4A10基因會是患者表現(xiàn)出預(yù)后不良。
研究評價：
該研究著重探索了衰竭T細胞和Tregs細胞的特異表達基因，發(fā)現(xiàn)基因Layilin在這兩群細胞中均特異性表達，同時，基于TCR數(shù)據(jù)分析，該研究發(fā)現(xiàn)肝癌內(nèi)存在大量腫瘤組織特異的克隆增生的T細胞，但是這些細胞大多處于耗竭狀態(tài)，從而揭示了腫瘤細胞逃逸免疫監(jiān)視的原因。此外，該研究還描繪了初始T細胞向耗竭狀態(tài)的發(fā)展軌跡，并在耗竭性CD8 T細胞亞群中發(fā)現(xiàn)了一類FOXP3+抑制性T細胞的存在，提出了耗竭T細胞會進一步發(fā)展成抑制性T細胞的潛在發(fā)展方向。
通過對外周血、癌旁和腫瘤三個部位的T細胞進行采集分析，獲得大規(guī)模的樣本量，進行單細胞測序分析，聚焦肝癌新靶點和生物標記物的探索，針對肝癌組織內(nèi)富含大量腫瘤浸潤淋巴細胞、肝癌免疫治療以及單細胞測序解決異質(zhì)性問題。利用生物信息學(xué)方法，不僅僅只對T細胞亞群中的基因和蛋白進行差異化分析，還追蹤了不同T細胞的來源和組織家譜，揭示了腫瘤中T細胞的轉(zhuǎn)化過程，更加明了的闡述了疾病的發(fā)展情況。在系統(tǒng)生物學(xué)的角度，通過大量的組學(xué)分析，多方面多維度地對肝癌相關(guān)的T細胞進行表征研究，為臨床治療提供了過度狀態(tài)的CD8細胞轉(zhuǎn)回成效應(yīng)T細胞和GZMA+ CD4細胞向溶解性CD4細胞轉(zhuǎn)變這兩種治療方案，加速了新的免疫治療的開創(chuàng)。
通過以前的研究和得到的數(shù)據(jù)分析出LAYN基因，作為T細胞的負調(diào)控因子，促進腫瘤的發(fā)生，具體的發(fā)生機理和生化反應(yīng)有待進一步挖掘。C5_CD8-GZMK cluster作為過渡態(tài)，介導(dǎo)效應(yīng)T細胞與衰竭T細胞的轉(zhuǎn)變，該過程只是在發(fā)育軌跡中有所表現(xiàn)，還缺少真正的事實依據(jù)。
