2015版《中國藥典》將于今年12月1日開始實(shí)施，關(guān)于微生物的部分，改變確實(shí)是比較大的，特別是非無菌產(chǎn)品的微生物限度檢查法，從培養(yǎng)基，方法適用性以及培養(yǎng)的條件等都有改變，針對這些改變，筆者想分開，每個步驟從細(xì)節(jié)上去剖析具體怎么做，所以會寫一個系列的介紹，這次先從非無菌產(chǎn)品微生物計(jì)數(shù)方法適用性開始寫，算是我的一點(diǎn)拙見，供大家參考。
一、計(jì)數(shù)方法
新版藥典的非無菌產(chǎn)品微生物計(jì)數(shù)方法為平皿法、薄膜過濾法和MPN（Most Probable-Number Method）法；其中，MPN法是今年新加入的方法，它的特點(diǎn)是用于微生物計(jì)數(shù)時精確度較差，此法不適合用于檢測酵母菌和霉菌，所以我們今天就不談?wù)撨@種方法；薄膜過濾法在實(shí)施時需要增加薄膜過濾器等設(shè)備，操作相對較復(fù)雜，所以一般在實(shí)際工作中，除非是藥品的抑菌作用較強(qiáng)，否則一般不會使用這種方法，所以我們就以使用最廣泛的平皿法為例來進(jìn)行說明。
二、微生物限度計(jì)數(shù)法——平皿法方法適用性
1、試驗(yàn)用菌的制備
取相應(yīng)菌，放相應(yīng)的培養(yǎng)基，適合的條件培養(yǎng)合適的時間，具體見表一
表一：
菌種信息
Information of Microorganisms
制備條件
Preparation Condition of Test Strains
名稱
Name in Chinese
學(xué)名
Microorganism Name
CMCC代碼
CMCCNumber
培養(yǎng)基
Media
培養(yǎng)溫度
Incubate Temperature
培養(yǎng)時間
Incubate Time
枯草芽孢桿菌
Bacillus subtilis
63501
TSA/TSB
30-35℃
18-24h
金黃色葡萄球菌
Staphylococcus aureus
26003
TSA/TSB
30-35℃
18-24 h
銅綠假單胞菌
Pseudomonas aeruginosa
10104
TSA/TSB
30-35℃
18-24 h
白色念珠菌
Candida albicans
98001
SDA
20-25℃
2-3 days
黑曲霉
Aspergillus niger
98003
SDA
20-25℃
5-7 days
備注：所有的菌，除了黑曲霉菌懸液可以存放在2-8℃，在驗(yàn)證的時間內(nèi)使用之外，所有的菌均需要使用新鮮的菌。
2、菌懸液的制備
將表一的菌種的新鮮培養(yǎng)物，細(xì)菌用接種環(huán)，取少許加入到10ml的無菌0.9%NaCl溶液中（如培養(yǎng)與TSB中，可使用移液器取1ml加到9ml 無菌0.9%NaCl溶液中），按照10倍逐級稀釋，計(jì)數(shù)，備用。（這部分需要摸索，所以一般要菌落計(jì)數(shù)時，要做2-3個稀釋級，保證最后實(shí)驗(yàn)的成功）。
霉菌：取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入3～5ml 含0.05％聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，混勻，使用含0.05％聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液進(jìn)行10倍逐級稀釋，備用；
白色念珠菌：取10ml的無菌0.9%NaCl溶液，全部加入到接種有白色念珠菌的斜面試管中，使用接種環(huán)，將菌全部刮下來，混勻，使用無菌0.9%NaCl溶液進(jìn)行逐級稀釋，備用。
3、供試液的制備
供試液的制備因?yàn)闆]有改變，所以按照公司原先的方法來進(jìn)行制備，這里不進(jìn)行贅述。
4、試驗(yàn)程序
1） 試驗(yàn)組：取上述制備好的供試液，加入試驗(yàn)菌液，混勻，使每1ml供試液中含菌量不大于100cfu。這里要注意，菌液是加入到供試液中，一般的供試液制備是100ml，藥典規(guī)定，加入菌液的體積不應(yīng)超過供試液體積的1%，也就是說，通常情況下，不但要使得100ml中的供試液中的每ml的供試液中含菌量不大于100CFU，加的菌液的總體積還不能超過1ml，這個和2010版《中國藥典》有很大的改變，所以在操作上要特別注意，在加菌的過程中，需要進(jìn)行一個換算，比如菌液在菌落計(jì)數(shù)時10-6這個稀釋級1ml菌落數(shù)是在30-100CFU之間，那么加入菌液的稀釋級就應(yīng)該是10-4，才能使得100ml的供試液中，每1ml的菌的含量不超過100CFU。將加好菌液的供試液混勻，取1ml到90mm平皿中，傾注45-50℃的培養(yǎng)基，用手輕搖使供試液和培養(yǎng)基充分混合，細(xì)菌使用TSA，培養(yǎng)時間不超過3天; 霉菌和酵母菌于20-25℃培養(yǎng), 培養(yǎng)時間不超過5天。計(jì)數(shù)。
2） 供試品對照組：取制備好的供試液，不加入菌液按照試驗(yàn)組同法操作，，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在 30～35℃培養(yǎng)3～5 天，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板在20～25℃培養(yǎng)5～7 天，查看菌落數(shù)。作為供試品對照組。
3） 菌液對照組：取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液,按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。
4） 計(jì)算回收率：
5） 回收率標(biāo)準(zhǔn)
每種菌的回收率在50%-200%之間。
5、抗菌活性的去除或滅活
抗菌活性的去除或滅活的方法有以下幾種方法
1） 增加稀釋液或培養(yǎng)基體積：增加稀釋液法和擴(kuò)大稀釋倍數(shù)法有本質(zhì)上的區(qū)別，擴(kuò)大稀釋倍數(shù)法是單純的按照一定的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋，供試液的取樣量是一樣的，但是擴(kuò)大稀釋液法，需要對供試液的取樣量做相應(yīng)的調(diào)整，同時使用的培養(yǎng)基也要相應(yīng)調(diào)整，這和2010版的培養(yǎng)基稀釋法有區(qū)別的。但筆者認(rèn)為，培養(yǎng)基稀釋法是可行的，如果確實(shí)擴(kuò)大稀釋液和培養(yǎng)基體積法無法消除抑菌作用，還是可以進(jìn)一步結(jié)合培養(yǎng)基稀釋法來做的。
2） 其他方法與2010版一致，這里就不多贅述了。
6、可接受標(biāo)準(zhǔn)：
計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，采用平皿法或薄膜過濾法或時，試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值應(yīng)0.5～2 范圍內(nèi)；若各試驗(yàn)菌的回收試驗(yàn)均符合要求，照所用的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。
方法適用性確認(rèn)時,若采用上述方法還存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收達(dá)不到要求,那么選擇回收最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢查。
值得注意的是，與2010版不同的是未規(guī)定需要進(jìn)行三次的獨(dú)立試驗(yàn)，并且三次試驗(yàn)中的各株菌的回收率都達(dá)到要求，才判定通過；所以可以根據(jù)情況，無需再強(qiáng)制要求每種產(chǎn)品都進(jìn)行三次獨(dú)立試驗(yàn)，因?yàn)閺亩x上來說，我們進(jìn)行的是方法適用性，是對已經(jīng)經(jīng)過驗(yàn)證的方法的確認(rèn)，而不是新方法的驗(yàn)證。
