山藥多糖治療糖尿病藥效學(xué)研究山藥多糖治療糖尿病藥效學(xué)研究山藥多糖治療糖尿病藥效學(xué)研究山藥多糖治療糖尿病藥效學(xué)研究 姓名姓名姓名姓名：：：：汪巖汪巖汪巖汪巖 學(xué)號(hào)學(xué)號(hào)學(xué)號(hào)學(xué)號(hào)：：：：S2010210 專業(yè)專業(yè)專業(yè)專業(yè)：：：：中藥學(xué)中藥學(xué)中藥學(xué)中藥學(xué) 山藥又稱“食物藥”，《本草綱目》記載，山藥有益腎氣、健脾胃、止瀉痢、潤(rùn)皮毛的作用，我國(guó)第一部醫(yī)學(xué)巨獻(xiàn)《神農(nóng)本草經(jīng)》，將山藥列為上品，認(rèn)為它有補(bǔ)虛，除寒熱邪氣，長(zhǎng)肌肉，久服耳聰目明的功能。國(guó)內(nèi)外對(duì)山藥功能性成分的報(bào)道很多，目前研究的最多的是 山藥中最主要的藥用成分山藥多糖，山藥多糖是從山藥塊莖中提取的一種有效成分，其含量約為2．15％～2．92％。有研究證實(shí)，山藥多糖具有多種藥理作用，如降血糖、抗衰老、增強(qiáng)免疫功能、抗突變、 抗腫瘤、抗氧化作用等[1~5]。據(jù)報(bào)道多糖可分為酸性多糖與中性多糖兩類，由甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成，國(guó)外有報(bào)道稱 山藥多糖中還含有一定量的甘露聚糖[6]。對(duì)于山藥多糖的降血糖作用，國(guó)內(nèi)外的研究?jī)H停留在其有降低血糖和刺激胰島素分泌的層面[7,8]，對(duì)于其具體的降糖機(jī)制的研究尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。 1 山藥多糖的提取山藥多糖的提取山藥多糖的提取山藥多糖的提取 取山藥藥材500g，加水冷浸12h，水煎煮1.5h，兩次，合并水煎液，加入2%新鮮配制的淀粉酶溶液于60℃保溫5min，目的是出去淀粉。再進(jìn)行抽濾，濾液濃縮至體積為500ml，以95%乙醇醇沉至含醇量為80%，靜置過(guò)夜，抽濾，濾渣依次經(jīng)無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，50℃真空干燥既得山藥多糖（粗多糖）。 ２２２２ 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與造模實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與造模實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與造模實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與造模 2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 取健康Wistar大鼠,隨機(jī)分為6組分組情況如表1. 表1. 組別 狀況 第一組 正常對(duì)照組 普通飼料喂養(yǎng) 等體積蒸餾水灌胃 第二組 糖尿病模型組 等體積蒸餾水灌胃 第三組 山藥多糖低劑量用藥組（40mg/kg） 第四組 山藥多糖中劑量用藥組（70mg/kg） 第五組 山藥多糖高劑量用藥組（100mg/kg） 第六組 陽(yáng)性對(duì)照組 二甲雙胍（100mg/kg） 2.2動(dòng)物造模及處理 將健康大鼠先于溫度25℃，相對(duì)濕度50%~60%室內(nèi)適應(yīng)一周。第一組灌服等體積蒸餾水；第二~六組給予高熱量飼料8周后，一次性尾靜脈注射小劑量35mg／kg STZ[STZ用 0．1mol／L檸檬酸一檸檬酸鈉溶液(PH4．0)稀釋成l％的溶液]，注射72h后，測(cè)定空腹血糖穩(wěn)定在13．5mmol／L以上者為造模成功。造模成功后第二組灌服等體積蒸餾水；對(duì)三~六組分別給予山藥多糖40、70、100mg/kg，二甲雙胍100mg／kg灌胃給藥4周，每天1次。灌胃結(jié)束后大鼠禁食過(guò)夜，測(cè)定空腹血糖；迅速切除肝組織和后腿肌肉組織，分別測(cè)定己糖 激酶和琥珀酸脫氫酶活性、蘋(píng)果酸脫氫酶活性。 分別于實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)第3、6、9、12周分別斷尾取血，用血糖測(cè)定儀測(cè)定空腹血糖值。將所得數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，最后得出山藥多糖對(duì)大鼠的糖尿病的治療是否有意義。 3 山藥多糖的體外實(shí)驗(yàn)研究山藥多糖的體外實(shí)驗(yàn)研究山藥多糖的體外實(shí)驗(yàn)研究山藥多糖的體外實(shí)驗(yàn)研究 3.1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞及培養(yǎng)方法 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)利用ECV304（人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株）進(jìn)行高糖對(duì)細(xì)胞的損傷作用及山藥多糖拮抗高糖損傷作用實(shí)驗(yàn)研究。細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用RPMI1640培養(yǎng)基。細(xì)胞傳代方法：細(xì)胞融合達(dá)到85-90%時(shí)，棄掉培養(yǎng)液，PBS沖洗2遍，吸取1.5 ml 0.25%胰酶至培養(yǎng)瓶中，室溫消化2
min后棄掉胰酶，迅速添加3-4 ml含15%胎牛血清（FBS）的RPMI培養(yǎng)液終止消化，制成單細(xì)胞懸液。將含15%FBS的RPMI培養(yǎng)液加入細(xì)胞懸液中，按每個(gè)培養(yǎng)瓶加入10 ml計(jì)算補(bǔ)足培養(yǎng)體系，吹打均勻并接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)條件：在37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。 3.2 山藥多糖拮抗高糖損傷作用實(shí)驗(yàn)研究 （1）山藥多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響 將ECV304細(xì)胞培養(yǎng)于含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，將細(xì)胞隨機(jī)分為四組，正常細(xì)胞組、高糖組（細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入葡萄糖使其終濃度為35 mM）、甘露醇高滲對(duì)照組（加入甘露醇至終濃度25 mM）、山藥多糖保護(hù)組（細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入葡萄糖至終濃度35 mM,同時(shí)加入GBE至終濃度500μg），待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%-80%匯合時(shí)，將培養(yǎng)液中的血清濃度換為1%，培養(yǎng)24h后換至含10%血清的RPMI培養(yǎng)液。按照不同的分組向細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入不同的處理因素，加入處理因素后繼續(xù)培養(yǎng)24h，24h后收集細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌2次（1500 rpm，5 min）后，加入Annexin V孵育45 min后，用PBS洗滌細(xì)胞2次，用200μl PBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行各組細(xì)胞凋亡情況測(cè)定。 （2）山藥多糖對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響 細(xì)胞分組及細(xì)胞處理同3.1。收集細(xì)胞后，用PBS洗滌2次，用PBS制成2×106 ·ml-1 單細(xì)胞懸液，取含有5×105個(gè)細(xì)胞的上述細(xì)胞懸液至1.5 ml離心管中，向離心管中加入Fluo-3/AM Ester使其終濃度至5μmol/L，混勻后，37℃孵箱中避光孵育45 min，用PBS洗滌細(xì)胞2次（1 500 rpm，5 min）；流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，檢測(cè)條件為激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)530 nm。 （3）山藥多糖對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響 細(xì)胞分組及細(xì)胞處理同3.1。收集細(xì)胞后，用PBS洗滌2次，用PBS制成2×106 ·ml-1 單細(xì)胞懸液，取含有5×105個(gè)細(xì)胞的上述細(xì)胞懸液至1.5 ml離心管中，向離心管中加入Rh 123使其終濃度達(dá)5 mg/L，混勻后置37℃孵箱中避光孵育45 min，PBS洗滌細(xì)胞2次（1 500 rpm，5 min）；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)CM檢測(cè)條件為激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)530 nm。 （4）山藥多糖對(duì)細(xì)胞影響的超微結(jié)構(gòu)觀察 用含15%FBS RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)ECV304細(xì)胞至融合度85-90%，將培養(yǎng)液換為含1.0%FBS的RPMI培養(yǎng)液同步細(xì)胞生長(zhǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。更換培養(yǎng)液為含10%FBS的RPMI培養(yǎng)液，細(xì)胞分組及處理同3.1。24 h后，收獲上述各組細(xì)胞，將細(xì)胞收集于0.5 ml離心管中（1 500 rpm，10 min），送電鏡室制片、觀察及照相。 （5）山藥多糖對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基的影響 細(xì)胞的培養(yǎng)、分組及處理同3.1，每組3瓶細(xì)胞。收獲各組細(xì)胞后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1 500 rpm離心5 min，棄上清，加入1 ml預(yù)冷的生理鹽水，冰浴5 min，超聲裂解細(xì)胞（強(qiáng)度以不產(chǎn)生泡沫為準(zhǔn)），12 000 rpm離心10 min，上清液移至1.5 ml微量離心管中。按試劑盒說(shuō)明書(shū)所示操作方法測(cè)定上清中SOD活力、MDA含量、超氧陰離子、羥自由基和總蛋白含量。 （6）山藥多糖對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響 細(xì)胞的培養(yǎng)、分組及處理同3.2.1，每組3瓶細(xì)胞。收獲細(xì)胞時(shí)，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，不經(jīng)酶消化處理，直接用PBS液吹打細(xì)胞使其脫壁；收集細(xì)胞懸液，用PBS將每組細(xì)胞分別制備成2×106·ml-1細(xì)胞懸液。將5-SA應(yīng)用液加入細(xì)胞中，終濃度為0.5 mmol/L。37℃水浴中保溫孵育0.5 h，然后用PBS溶液反復(fù)洗滌細(xì)胞（1 500 rpm，5min），直至上清液中檢測(cè)不出電子自旋共振信號(hào)。將標(biāo)記好的細(xì)胞吸入毛細(xì)管中，測(cè)量其電子自旋共振波譜，檢測(cè)條件：場(chǎng)強(qiáng)3366±100 G，振幅4×103，微波功率10 mW。
3.3統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間測(cè)定指標(biāo)比較用方差分析。
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