摘 要
DNA甲基化是哺乳動(dòng)物中研究最為深入的表觀遺傳修飾之一。正常細(xì)胞中，DNA 甲基化有效的調(diào)控基因表達(dá)水平。某些抑癌基因的失活是由于啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化，大量實(shí)驗(yàn)研究表明，在多種類型癌癥中，DNA甲基化導(dǎo)致了大范圍的基因沉默。除了啟動(dòng)子區(qū)域和DNA重復(fù)序列中的甲基化水平改變外，甲基化還與非編碼RNA（如腫瘤抑制作用相關(guān)的microRNA）的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。
DNA甲基化水平與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的聯(lián)系，鼓勵(lì)著我們不斷的解碼人類表觀基因組。甲基化測序是研究不同生命過程中基因調(diào)控的一個(gè)重要工具，例如細(xì)胞分化和疾病進(jìn)展，并且越來越多的應(yīng)用到包括腫瘤早篩、診斷等臨床檢測中。全基因組甲基化測序（WGBS）允許無偏好性的進(jìn)行單堿基分辨率檢測，是理想的檢測目標(biāo)區(qū)域方法。當(dāng)您想進(jìn)一步研究感興趣的目標(biāo)基因組區(qū)域，經(jīng)過雜交捕獲后再測序，這種有針對性的甲基化測序檢測方案成本更低。特別地，在評(píng)估具有低水平甲基化特征的復(fù)雜樣本時(shí)（如液體活檢中的游離DNA），一般需比常規(guī)全基因組甲基化測序達(dá)到更高的測序深度，雜交捕獲成為理想的實(shí)驗(yàn)方案。
什么是甲基化
在哺乳動(dòng)物中，負(fù)責(zé)5-甲基胞嘧啶（5mC）形成的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶包括DNMT1，DNMT3A及DNMT3B。DNMT1酶可以識(shí)別半甲基化的DNA，并保證維持現(xiàn)有的甲基化模式；DNMT3A和DNMT3B會(huì)在未甲基化的胞嘧啶上添加甲基基團(tuán)。除了5-甲基胞嘧啶（5mC），5-羥甲基胞嘧啶（5hmc）為已發(fā)現(xiàn)胞嘧啶的甲基化中間產(chǎn)物，與5-甲基胞嘧啶（5mC）都為哺乳動(dòng)物基因組中發(fā)現(xiàn)的兩種最常見的表觀遺傳標(biāo)記，通過雙加氧酶家族TET（包括TET1、TET2和TET3）蛋白，將5-甲基胞嘧啶（5mC）氧化為5-羥甲基胞嘧啶（5hmc）[2]。DNA的5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羥甲基胞嘧啶（5hmc）水平，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。
甲基化與癌癥
癌癥的發(fā)生、發(fā)展伴隨著DNA甲基化模式的改變，包括了逆轉(zhuǎn)錄元件、著絲粒及原癌基因的DNA低甲基化，以及與基因抑制相關(guān)的關(guān)鍵基因調(diào)控元件（如遠(yuǎn)端增強(qiáng)子和啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始的重疊區(qū)域）的甲基化。如下圖所示，在整個(gè)基因組的所有基因調(diào)控元件，正常細(xì)胞和癌癥細(xì)胞之間的DNA甲基化模式存在廣泛差異。正?；蚪M中的大部分CpG位點(diǎn)都攜帶著5mC，而遠(yuǎn)端增強(qiáng)子元件及CpG島區(qū)域?qū)谆D(zhuǎn)移酶DNMT的活性具有抗性。癌細(xì)胞主要表現(xiàn)特征為整體范圍的失去甲基化遺傳學(xué)修飾，反而增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)異常的甲基化位點(diǎn)。這種甲基化分布的改變，導(dǎo)致了腫瘤抑癌基因的表達(dá)受抑制，并伴隨著原癌基因表達(dá)的增加，從而進(jìn)一步推動(dòng)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。（在下圖中，白色圓圈代表未甲基化CpG位點(diǎn)；黑色圓圈代表甲基化CpG位點(diǎn)[1]）。
DNA甲基化為常見的腫瘤標(biāo)志物
甲基化檢測應(yīng)用
2020年6月，GRAIL在歐洲腫瘤學(xué)會(huì)（ESMO）旗下期刊《腫瘤學(xué)年鑒》（Annals of Oncology）發(fā)表了CCGA（Circulating Cell-free Genome Atlas，CCGA）的三個(gè)子項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在CCGA1的原理發(fā)現(xiàn)階段，使用訓(xùn)練集樣本1785例及驗(yàn)證集樣本1015例，同時(shí)對三種不同的高通量測序（NGS）方案進(jìn)行評(píng)估，包括了靶向測序、全基因組測序（拷貝數(shù)變異，CNV）及全基因組亞硫酸氫鹽測序 （WGBS）。驗(yàn)證結(jié)果證明， 相比于DNA突變水平檢測，WGBS技術(shù)路線更適合應(yīng)用于癌癥早篩的研究領(lǐng)域[6]。GRAIL也同時(shí)公布了其結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法的cfDNA的甲基化測序分析技術(shù)可以同時(shí)檢測五十多種癌癥類型，其檢測的特異性>99%，并且對腫瘤信號(hào)組織來源的預(yù)測準(zhǔn)確性>90%[6]。由于CCGA是一項(xiàng)病例對照研究，可能無法真實(shí)的反映該血液檢測在普通人群篩查情況下的表現(xiàn)。目前，研究團(tuán)隊(duì)仍在持續(xù)進(jìn)行PATHFINDER實(shí)驗(yàn)，通過納入更多的健康人群，以評(píng)估檢測方案在臨床護(hù)理環(huán)境中的實(shí)施及性能。
甲基化應(yīng)用的另一個(gè)方向?yàn)镸RD（Minimal Residual Disease），即微小殘留病灶(是指癌癥治療后殘留在體內(nèi)的少量癌細(xì)胞（對治療無反應(yīng)或耐藥的癌細(xì)胞））。2021年4月，《臨床腫瘤研究》（Clinical Cancer Research）在線發(fā)表了名為《Minimal Residual Disease Detection using a Plasma-only Circulating Tumor DNA Assay in Patients with Colorectal Cancer》文章，Guardant Reveal首次公開了僅使用血漿ctDNA MRD的檢測數(shù)據(jù)，證明MRD檢測靈敏度達(dá)到91%，特異性達(dá)100%。Guardant Reveal的MRD技術(shù)路線是Tumor-agnostic策略，又稱為Tumor-uninformed，即僅依賴于血漿ctDNA進(jìn)行MRD檢測（無需組織活檢），檢測方案為整合ctDNA突變（LOD為0.01％ctDNA）及ctDNA甲基化水平檢測（見下圖）。該研究表明，通過整合表觀基因組標(biāo)記，如DNA甲基化分析，比單獨(dú)基因組水平突變檢測靈敏度更高[7]。
甲基化檢測之NGS方法及流程
重亞硫酸氫鹽處理一直是繪制DNA甲基化圖譜的金標(biāo)準(zhǔn)，由來自澳大利亞的Kanematsu等科學(xué)家開發(fā)的技術(shù)方案[10，11]，DNA經(jīng)重亞硫酸氫鹽處理后，其胞嘧啶殘基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶殘基，5-甲基胞嘧啶（5mC）則保持不變，各檢測方案對比見下表[9]：
1
重亞硫酸鹽處理后所產(chǎn)生的損傷DNA模版， 其中有一定的比例無法結(jié)合引物，從而降低了測序文庫的分子復(fù)雜度；
2
隨機(jī)擴(kuò)增有著模版偏好性。
值得注意的是，PBAT方案的改良版本也一直用于單細(xì)胞甲基化分析方案中。
總 結(jié)
甲基化測序是研究不同生命過程中基因調(diào)控的一個(gè)重要工具，例如細(xì)胞分化和疾病進(jìn)展，并且越來越多的應(yīng)用到包括腫瘤早篩、分診、治療選擇、微小殘留監(jiān)測、復(fù)發(fā)檢測等臨床領(lǐng)域中。包括游離核酸在內(nèi)的體液樣本，含有來自于腫瘤的特異的DNA甲基化信號(hào)，作為生物標(biāo)志物樣本檢測來源，無疑是一個(gè)絕佳的選擇。
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