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原名：Circular RNA circSLC8A1 acts as a sponge of miR-130b/miR-494 in suppressing bladder cancer progression via regulating PTEN  

譯名：環(huán)狀RNA circSLC8A1海綿miR-130b/miR-494通過調節(jié)PTEN抑制膀胱癌進展

期刊：Molecular Cancer

IF：10.67（2018影響因子）

發(fā)表時間：2019年

通訊作者：郭宏騫

通訊作者單位：南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院

DOI號：10.1186/s12943-019-1040-0

從RNA測序數據中鑒定出差異表達的circRNA，并將circSLC8A1確定為一個新的候選circRNA。qRT-PCR法檢測circRNAs、miRNAs和mRNAs在人體組織和細胞中的表達。采用RNA下拉實驗和熒光素酶報告實驗研究特異性circRNA、miRNA與mRNA之間的相互作用。體外和體內轉染質粒，觀察circSLC8A1對膀胱癌細胞的作用。Western blot檢測PTEN的表達。通過劃痕實驗、Transwell實驗和CCK-8實驗檢測其生物學作用。

1. CircSLC8A1(hsa_circ_0000994)在膀胱癌中的表達顯著下調

CircSLC8A1起源于SLC8A1基因，由外顯子1(1832bp)的頭尾拼接組成 (圖 1a)。為探討circSLC8A1在膀胱癌組織中的表達情況，研究人員檢測了70對膀胱癌組織和正常膀胱組織中circSLC8A1的表達水平，結果證實circSLC8A1在膀胱癌組織中明顯低表達 (圖 1b)。值得注意的是，對膀胱癌腫瘤樣本的配對分析顯示，在所有患者樣本中，circSLC8A1的表達減少的標本數超過80% (圖 1c)。相關分析顯示，circSLC8A1的表達與臨床病理特征(包括病理分期和組織學分級)相關(表 1)。此外，circSLC8A1在6個膀胱癌細胞系(5637、T24、J82、EJ、UMUC和RT4)中的表達低于正常尿路上皮細胞系SV-HUC-1 (圖 1d)。接下來，研究設計了聚斂引物來擴增SLC8A1 mRNA，發(fā)散性引物來擴增circSLC8A1。以5637和T24細胞的cDNA和gDNA(基因組DNA)為模板，circSLC8A1在cDNA中只被發(fā)散性引物擴增，而在gDNA中沒有觀察到擴增產物(圖 1e)。通過qRT-PCR進一步證實circSLC8A1對RNase R具有抗性，而RNase R處理后的SLC8A1 mRNA顯著減少(圖 1f)。

圖 1 CircSLC8A1在膀胱癌組織和細胞系中顯著下調。a SLC8A1外顯子1形成環(huán)狀SLC8A1的示意圖。RT-PCR證實了circSLC8A1的存在，Sanger測序證實了circSLC8A1的后剪接。紅色箭頭表示circSLC8A1的特殊拼接位點。b和c采用不同引物的qRT-PCR檢測證實，70對人膀胱癌組織中circSLC8A1的表達水平均低于癌旁正常組織。d 用qRT-PCR檢測circSLC8A1在SV-Huc-1和膀胱癌細胞系中的表達。e RT-PCR證實在5637和T24細胞系中存在circSLC8A1。發(fā)散性引物可在cDNA中擴增circSLC8A1，但在基因組DNA(gDNA)則不能。f 采用qRT-PCR方法檢測RNase R處理前后5637和T24細胞中CircSLC8A1和SLC8A1mRNA的表達。

2. 過表達circSLC8A1抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲

鑒于本研究中circSLC8A1在膀胱癌組織和細胞系中表達下調，研究人員將circSLC8A1表達載體轉染5637和T24細胞，并顯著上調了circSLC8A1的表達(圖 2a)。同時，SLC8A1 mRNA的表達無明顯變化(圖 2a)。細胞劃痕實驗顯示，circSLC8A1的過表達顯著抑制了5637和T24細胞的遷移(圖 2b)。細胞侵襲和遷移實驗一致表明，circSLC8A1的過表達也抑制了膀胱癌細胞系的遷移和侵襲能力。(圖 2c和2d)。將針對circSLC8A1連接位點的siRNA轉染5637和T24細胞。這些siRNA顯著降低了circSLC8A1的表達，但對SLC8A1 mRNA沒有影響(圖 2e)。細胞劃痕實驗和Transwell分析表明，敲除circSLC8A1顯著增加了5637和T24細胞的遷移和侵襲能力 (圖2f-h)。

圖 2 CircSLC8A1過表達抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲。a qRT-PCR檢測轉染circSLC8A1或對照載體質粒后5637和T24細胞中circSLC8A1和SLC8A1mRNA的表達水平。b 通過劃痕實驗觀察circSLC8A1對5637和T24細胞遷移能力的影響。c and d  通過遷移和侵襲實驗檢測轉染circSLC8A1和對照載體的5637和T24細胞的遷移和侵襲能力。e將兩個針對circSLC8A1的siRNA轉染5637和T24細胞。采用qRT-PCR檢測各siRNA對circSLC8A1和SLC8A1mRNA的干擾效果。f 通過劃痕實驗，分別觀察了circSLC8A1-1對5637和T24細胞遷移能力的影響，并用流式細胞儀檢測了sIcSLC8A1-1對細胞遷移能力的影響。g and h 用遷移和侵襲實驗檢測轉染si circSLC8A1-1或siNC的5637和T24細胞的遷移和侵襲能力。

3. circSLC8A1在膀胱癌細胞中作為miR-130b和miR-494的海綿

生物素標記的探針在5637、T24和SV-HUC-1細胞系中被證實能下拉circSLC8A1(圖 3a和b)。檢測了7個候選miRNAs的水平，結果表明在5637和T24細胞中miR-130b和miR-494是僅有的兩個miRNAs能被circSLC8A1充分下拉(圖 3c、d和e)。生物素標記的miR-130b/miR-494比生物素標記的陰性對照捕獲了更多的circSLC8A1(圖 3f和g)。此外，RNA FISH實驗表明，circSLC8A1和miR-130b/miR-494共定位于細胞質中(圖3h和i)。

圖 3 CircSLC8A1在膀胱癌細胞中作為miR-130b和miR-494的海綿。a and b 將5637、T24和SV-HUC-1裂解產物中的circSLC8A1拉下，用circSLC8A1特異性探針富集，然后用qRT-PCR進行檢測。C, d and e 用qRT-PCR檢測5637、T24和SV-HUC-1裂解產物中7個候選miRNA的相對水平。在5637和T24細胞系中，circSLC8A1探針可以拖拽多個miRNA，并且miR-130b和miR-494都可以被circSLC8A1探針拖拽。f and g 將生物素標記的miR-130b或miR-494轉染5637和T24細胞。鏈霉親和素捕獲后，用qRT-PCR定量檢測circSLC8A1的水平。h and i RNA FISH實驗檢測T24中circSLC8A1和miR-130b/miR-494的共定位情況。細胞核染成藍色(DAPI)，circSLC8A1染成紅色，miR-130b/miR-494染成綠色。

4. miR-130b和miR-494通過靶向PTEN促進膀胱癌進展

qRT-PCR結果顯示，與正常膀胱組織相比，膀胱癌組織中miR-130b和miR-494表達上調(圖 4a和b，表2)。相關分析顯示，circSLC8A1的表達與miR-130b或miR-494呈負相關(圖 4c和d)。過表達miR-130b和miR-494顯著促進了5737和T24細胞的增殖(圖 4e和f)。Transwell分析表明，miR-130b或miR-494的過表達顯著促進了5637和T24細胞的遷移和侵襲(圖 4g和h)。相反，轉染miR-130b/miR-494抑制劑明顯抑制5637和T24細胞的遷移和侵襲(圖 4i和j)。根據TargetScan (http://www.targetscan.org/) 和Miranda預測，研究者發(fā)現(xiàn)miR-130b和miR-494都能與PTEN的3’-UTR區(qū)域結合(圖 4k)。接下來，進行熒光素酶報告分析來驗證這種相互作用。結果表明，與模擬物NC相比，轉染miR-130b或miR-494模擬物可顯著降低攜帶野生型PTEN 3’-UTR的熒光素酶報告基因的活性。相反，突變的熒光素酶報告不受miR-130b或miR-494過表達的影響(圖 4l)。Western blot分析表明，miR-130b或miR-494模擬物可以抑制PTEN的表達(圖 4m)。

圖 4 miR-130b和miR-494通過靶向PTEN促進膀胱癌進展。a and b qRT-PCR結果顯示，30例膀胱癌組織中miR-130b和miR494的表達均高于癌旁正常組織。c and d 皮爾遜相關分析提示circSLC8A1的表達與miR-130b/miR-494呈負相關。e and f CCK-8實驗顯示miR-130b和miR-494對5637和T24細胞的增殖有促進作用。g and h 遷移和侵襲實驗表明，轉染miR-130b或miR-494模擬物的5637和T24細胞的遷移和侵襲能力增強。i and j 轉染抗miR-130b或抗miR-494可抑制5637和T24細胞的遷移和侵襲。k 生物信息學分析預測miR-130b/miR-494結合位點在PTEN mRNA 3’-UTR中。l 熒光素酶報告實驗證實miR-130b/miR-494與PTEN mRNA的相互作用。m miR-130b和miR-494分別降低PTEN蛋白表達水平。

5. CircSLC8A1通過靶向miR-130b和miR-494調節(jié)PTEN表達并抑制膀胱癌進展

CircSLC8A1的過表達導致膀胱癌細胞的侵襲和增殖能力受到抑制，但這種作用可以被miR-130b或miR494的異位表達部分減弱(圖 5a，b和c)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，與單獨轉染circSLC8A1質粒的細胞相比(圖 5d和e)，共同轉染circSLC8A1質粒和miR-130b/miR-494模擬物的膀胱癌細胞中PTEN的表達明顯降低，這與細胞功能的結果一致。此外，膀胱癌組織中PTEN蛋白的表達水平明顯低于癌旁組織(圖 5f)。上述結果表明，circSLC8A1通過海綿miR-130b/miR-494和調節(jié)PTEN的表達來抑制膀胱癌的進展。

圖 5 CircSLC8A1通過靶向miR-130b和miR-494調節(jié)PTEN的表達，抑制膀胱癌的進展。a, b and c Transwell侵襲和CCK-8檢測顯示，CircSLC8A1抑制5637和T24細胞的侵襲和增殖，當與miR-130b或miR-494共轉染時，抑制作用被逆轉。d and e Western blot結果顯示，miR-130b和miR-494可部分降低circSLC8A1促進的PTEN蛋白表達水平。f 10對人膀胱癌組織及癌旁正常組織中PTEN蛋白的Western blot分析。

6. CircSLC8A1體內抑制膀胱癌腫瘤生長的實驗研究

裸鼠皮下注射癌細胞后每周測量腫瘤體積。與對照組相比，circSLC8A1過表達組的生長速度和腫瘤重量顯著降低(圖 6c和d)。在circSLC8A1過表達組中，circSLC8A1表達水平上調，然而根據qRT-PCR結果，miR-130b和miR-494水平下調(圖 6e)。IHC分析表明，通過過度表達circSLC8A1(圖 6f)，PTEN在腫瘤中的表達增加。這些結果表明，circSLC8A1過表達能有效地抑制膀胱癌的體內生長。

圖 6 CircSLC8A1在體內對膀胱癌腫瘤的生長有抑制作用。a 將穩(wěn)定轉染circSLC8A1或對照載體的T24細胞皮下注射至裸鼠皮下，建立皮下移植瘤(n=6)。b 裸鼠異種移植瘤形成示意圖。c and d 與空白載體組相比，circSLC8A1處理組裸鼠的腫瘤生長率和重量均顯著降低。e采用qRT-PCR方法檢測腫瘤組織中circSLC8A1、miR-130b和miR-494的表達水平。f 免疫組化染色檢測移植瘤中PTEN、AKT、p-AKT和MMP9的表達。

綜上所述，研究結果表明，circSLC8A1在膀胱癌組織和細胞系中表達下調，并且它能夠作為miR-130b和miR-494的海綿來調節(jié)PTEN的表達。此外，還證明了通過靶向miR-130b、miR-494/PTEN軸，circSLC8A1的過表達可以有效地抑制膀胱癌的進展。研究結果不僅解釋了circRNA調控膀胱癌細胞生長的機制，而且為膀胱癌的治療提供了一個潛在的生物標志物和治療靶點。