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預(yù)測處理是一個(gè)計(jì)算框架，已被提出來解釋皮質(zhì)功能以及皮質(zhì)功能障礙的癥狀。預(yù)測處理假設(shè)在皮層中存在預(yù)測錯(cuò)誤神經(jīng)元。在視覺皮層的第2/3層中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了具有負(fù)性和陽性預(yù)測錯(cuò)誤反應(yīng)特性的神經(jīng)元，但它們是否對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)錄定義的亞群尚不清楚。
基于此，2023年9月20日Georg B. Keller研究團(tuán)隊(duì)在Neuron發(fā)表論文“Molecularly targetable cell types in mouse visual cortex have distinguishable prediction error responses”。揭示了小鼠視覺皮層中的分子靶向細(xì)胞類型具有可區(qū)分的預(yù)測錯(cuò)誤反應(yīng)。
在小鼠V1的 L2/3 中，已鑒定出三種轉(zhuǎn)錄定義的興奮性神經(jīng)元類型，每種類型均以差異表達(dá)基因之一命名：Adamts2、Agmat 和Rrad。在這里，作者使用CaMPARI2來標(biāo)記小鼠視覺皮層第2/3層的神經(jīng)元。對(duì)這些群體進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序，發(fā)現(xiàn)先前的Adamts2和Rrad層2/3轉(zhuǎn)錄細(xì)胞類型分別在驅(qū)動(dòng)負(fù)或正預(yù)測錯(cuò)誤反應(yīng)的刺激中進(jìn)行光標(biāo)記時(shí)富集。最后，通過設(shè)計(jì)用于AAV載體表達(dá)基因編碼鈣指標(biāo)的人工啟動(dòng)子，在功能上驗(yàn)證了這些結(jié)果。因此，可以使用AAV載體靶向的第2/3層中轉(zhuǎn)錄上不同的細(xì)胞類型表現(xiàn)出可區(qū)分的陰性和陽性預(yù)測錯(cuò)誤反應(yīng)。體內(nèi)功能標(biāo)記可識(shí)別皮層中分子定義的細(xì)胞類型，Adamts2和Baz1a細(xì)胞類型具有不同的預(yù)測誤差響應(yīng)曲線，作者設(shè)計(jì)了人工AAV向量來針對(duì)這些預(yù)測錯(cuò)誤類型。
圖一 使用CaMPARI2進(jìn)行功能標(biāo)記
作者使用CaMPARI2（一種工程熒光蛋白，只有當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣水平較高時(shí)，紫色照明才能將其從綠色光轉(zhuǎn)化為紅色），選擇了基于CaMPARI2的方法，而不是雙光子靶向光轉(zhuǎn)換方法，因?yàn)樗诠廪D(zhuǎn)換細(xì)胞中的產(chǎn)量更高。先前的研究表明，CaMPARI2可以根據(jù)體內(nèi)的活性水平來區(qū)分神經(jīng)元。因此，通過將光轉(zhuǎn)換光與特定刺激同步，可以光標(biāo)記對(duì)該刺激表現(xiàn)出鈣反應(yīng)的神經(jīng)元。一旦CaMPARI2表達(dá)，所有小鼠在虛擬現(xiàn)實(shí)環(huán)境中都經(jīng)歷了相同的視覺運(yùn)動(dòng)范式。小鼠頭部固定在一個(gè)球形跑步機(jī)上，周圍是一個(gè)環(huán)形屏幕。在90 min的過程中，小鼠第一次經(jīng)歷了一個(gè)閉環(huán)過程，在這個(gè)過程中，跑步與環(huán)形屏幕上的視覺流反饋耦合。在此過程中，為了驅(qū)動(dòng)負(fù)面的預(yù)測錯(cuò)誤反應(yīng)，以隨機(jī)時(shí)間內(nèi)視覺流動(dòng)的短暫停止的形式引入了視覺運(yùn)動(dòng)不匹配。預(yù)測錯(cuò)誤神經(jīng)元不能僅用一個(gè)刺激來唯一地識(shí)別，而且沒有一種類型的預(yù)測錯(cuò)誤會(huì)驅(qū)動(dòng)所有的預(yù)測錯(cuò)誤神經(jīng)元。對(duì)視覺運(yùn)動(dòng)相互作用有反應(yīng)的負(fù)性預(yù)測錯(cuò)誤神經(jīng)元對(duì)視覺運(yùn)動(dòng)不匹配表現(xiàn)出強(qiáng)烈的反應(yīng)，對(duì)同一視覺流停止刺激的被動(dòng)觀察沒有或有較弱的反應(yīng)。相反，正預(yù)測錯(cuò)誤神經(jīng)元應(yīng)該由未預(yù)測的視覺輸入驅(qū)動(dòng)，但當(dāng)輸入可預(yù)測時(shí)應(yīng)該響應(yīng)較弱。在所有的實(shí)驗(yàn)過程中，小鼠都可以在跑步機(jī)上自由奔跑。接下來，作者通過進(jìn)行一組單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)，測試了視覺運(yùn)動(dòng)錯(cuò)配事件下的光刺激是否會(huì)優(yōu)先于光轉(zhuǎn)換錯(cuò)配反應(yīng)神經(jīng)元，在這些實(shí)驗(yàn)中，測量了CaMPARI2的功能反應(yīng)以及光轉(zhuǎn)換后的紅綠熒光比。當(dāng)CaMPARI2與鈣結(jié)合時(shí)，其綠色熒光降低，因此CaMPARI2也可以作為鈣的指示劑。比較了同一神經(jīng)元中的光轉(zhuǎn)換水平和鈣對(duì)視覺運(yùn)動(dòng)不匹配的反應(yīng)。視覺運(yùn)動(dòng)錯(cuò)配過程中的光轉(zhuǎn)換優(yōu)先標(biāo)記視覺運(yùn)動(dòng)錯(cuò)配反應(yīng)神經(jīng)元。然后使用三個(gè)光轉(zhuǎn)換組中所有分類的細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序。
圖二 光轉(zhuǎn)換細(xì)胞的單細(xì)胞RNA測序
作者總共對(duì)50,449個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了測序。所有樣本的測序平均讀取深度為2.64億次讀取，每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生4294個(gè)獨(dú)特的分子標(biāo)識(shí)符。使用了生物信息學(xué)策略來利用V1發(fā)布的參考數(shù)據(jù)集的能力，該數(shù)據(jù)集具有更高的讀深度用于細(xì)胞分類。作者將兩個(gè)數(shù)據(jù)集對(duì)其他進(jìn)行對(duì)齊，并使用加權(quán)最近鄰算法將組身份分配給所有細(xì)胞。這三種L2/3細(xì)胞類型以這三種細(xì)胞類型之間存在差異表達(dá)的三個(gè)標(biāo)記基因命名。雖然標(biāo)記基因的表達(dá)與細(xì)胞類型的身份重疊，但標(biāo)記基因的表達(dá)并不能唯一地識(shí)別細(xì)胞類型，這三種基因在所有三種細(xì)胞類型中都有一定程度的表達(dá)。
圖三 L2/3興奮性細(xì)胞類型的分配
轉(zhuǎn)錄細(xì)胞類型是由不是一種表達(dá)而是一組基因定義的，這些基因的表達(dá)共同構(gòu)成了細(xì)胞類型。將這些差異表達(dá)數(shù)據(jù)中基因的表達(dá)模式與參考數(shù)據(jù)集中的表達(dá)模式進(jìn)行了比較。量化細(xì)胞類型分配的相似性，通過計(jì)算標(biāo)記基因的表達(dá)模式之間的相關(guān)性在作者的數(shù)據(jù)和參考數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)這些相關(guān)性高于所有三種細(xì)胞類型。因此，盡管測序深度較低，可以確定數(shù)據(jù)集中的轉(zhuǎn)錄細(xì)胞類型身份。推測L2/3興奮性轉(zhuǎn)錄細(xì)胞類型可能在功能上有所不同。例如，在L2/3 Rrad型的情況下，在桶狀皮質(zhì)中發(fā)現(xiàn)Baz1a陽性神經(jīng)元對(duì)感官刺激有強(qiáng)烈的反應(yīng)。測試這些細(xì)胞類型是否有不同的功能反應(yīng)屬性，數(shù)據(jù)集中的所有細(xì)胞類型中，發(fā)現(xiàn)在所有三個(gè)高光轉(zhuǎn)換組中，中間神經(jīng)元都有系統(tǒng)的富集。
圖四 不同光轉(zhuǎn)換組中L2/3興奮性轉(zhuǎn)錄細(xì)胞類型的差異富集
與在中間神經(jīng)元中觀察到的通常較高的鈣活性水平相一致，并強(qiáng)調(diào)了重點(diǎn)分析不同光轉(zhuǎn)換組之間的差異富集的重要性。作者只關(guān)注L2/3興奮性細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Rrad神經(jīng)元在高視覺光轉(zhuǎn)換組中富集Adamts2神經(jīng)元在高失配光轉(zhuǎn)換組中富集。
圖五 人工啟動(dòng)子在皮層中表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式
為了證實(shí)這些細(xì)胞類型也有不同的功能反應(yīng)，即Adamts2型神經(jīng)元具有強(qiáng)于平均的錯(cuò)配反應(yīng)，以及Rrad型神經(jīng)元具有強(qiáng)于平均的光柵反應(yīng)，根據(jù)3種細(xì)胞類型對(duì)應(yīng)的選定標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)周圍有2 kb的片段，設(shè)計(jì)了人工啟動(dòng)子。首先使用這些啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)eGFP的表達(dá)，并檢測了V1的層流表達(dá)譜。成功的候選啟動(dòng)子是L2/3 Adamts2細(xì)胞類型的Adamts2基因，L2/3 Agmat細(xì)胞類型的Agmat基因，以及L2/3 Rrad細(xì)胞類型的Baz1a基因。作者最初嘗試用一個(gè)基于Rrad基因的人工啟動(dòng)子來標(biāo)記L2/3 Rrad細(xì)胞類型；然而，表達(dá)量太弱和非常稀疏。在L2/3中，AP.Adamts2.1陽性神經(jīng)元傾向于比AP.Baz1a.1陽性神經(jīng)元更淺，這與V1L2/3深層神經(jīng)元對(duì)視覺刺激更敏感的發(fā)現(xiàn)相一致。對(duì)于這些啟動(dòng)子，作者比較了高表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞之間的RNA表達(dá)譜。為此，首先將分離的組織分類為低eGFP和高eGFP的細(xì)胞，然后對(duì)這些群體進(jìn)行批量RNA測序。
圖六 人工啟動(dòng)子靶向的L2/3神經(jīng)元表現(xiàn)出不同的視覺運(yùn)動(dòng)反應(yīng)
Adamts2.1神經(jīng)元比它們在AP.Baz1a.1和AP.Agmat.1群體中要多。相反，AP.Baz1a.1群體的光柵起始響應(yīng)強(qiáng)于其他兩個(gè)標(biāo)記群體。與視覺流和運(yùn)動(dòng)相關(guān)輸入對(duì)負(fù)預(yù)測錯(cuò)誤神經(jīng)元和正預(yù)測錯(cuò)誤神經(jīng)元的相反影響相一致，作者發(fā)現(xiàn)AP.Baz1a.1神經(jīng)元的活動(dòng)與視覺流速度呈正相關(guān)，而AP的活動(dòng)與視覺流速度呈正相關(guān)Adamts2.1神經(jīng)元與視覺流動(dòng)速度呈負(fù)相關(guān)。在與跑步速度的相關(guān)性方面，AP.Adamts2.1神經(jīng)元表現(xiàn)出較強(qiáng)的正相關(guān)，而AP.Baz1a.1神經(jīng)元表現(xiàn)出較弱的負(fù)相關(guān)。AP.Agmat.1神經(jīng)元的活動(dòng)與視覺流動(dòng)速度無關(guān)，而與AP.Adamts2.1和AP.Baz1a.1神經(jīng)元的運(yùn)行速度相關(guān)。
總之，作者的研究結(jié)果表明，分子定義的第2/3層細(xì)胞類型具有可區(qū)分的預(yù)測錯(cuò)誤反應(yīng)。鑒于預(yù)測處理已經(jīng)成為皮層功能的主要理論能夠解釋神經(jīng)生理學(xué)的結(jié)果，以及皮層的功能障礙被認(rèn)為導(dǎo)致自閉癥和精神分裂癥，必須有特定的基因訪問功能確定神經(jīng)亞群假設(shè)這個(gè)框架。不同的預(yù)測處理環(huán)路模型的實(shí)驗(yàn)測試將取決于細(xì)胞類型特異性的操作和神經(jīng)元活動(dòng)的記錄。與此同時(shí)，任何涉及預(yù)測誤差計(jì)算的疾病的治療都可能需要特定細(xì)胞類型的干預(yù)。此外，操縱L2/3中預(yù)測錯(cuò)誤類型的能力也可能有助于闡明深層神經(jīng)元的作用。該研究揭示了小鼠視覺皮層 2/3層的轉(zhuǎn)錄特性和計(jì)算功能之間的關(guān)系。通過他們將體內(nèi)功能標(biāo)記、單細(xì)胞RNA 測序和細(xì)胞類型特異性AAV相結(jié)合，證明發(fā)出意外刺激信號(hào)的神經(jīng)元在轉(zhuǎn)錄上是不同的。
https://doi.org/10.1016/j.neuron.2023.08.015
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