文章題目：A Cd9+Cd271+ stem/progenitor population and the SHP2 pathway contribute to neonatal-to-adult switching that regulates tendon maturation
期刊：Cell Reports
影響因子: 1區(qū) 9.423
發(fā)表時間: 2022年4月26日
DOI：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.110762
問題：成熟腱鞘的再生能力低，受傷的肌腱很少能完全恢復(fù)。恢復(fù)功能性肌腱需要更全面地了解肌腱成熟的細(xì)胞和分子機(jī)制。與我們對胚胎期肌腱發(fā)育的深入了解相比，對肌腱的成熟知之甚少。
方法：結(jié)合了跟腱體內(nèi)模型，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和功能驗證
結(jié)論：第7-14天是肌腱成熟的關(guān)鍵過渡階段，神經(jīng)生長因子（NGF）分泌Cd9+Cd271+干細(xì)胞/祖細(xì)胞群和受體酪氨酸激酶（RTK）信號通路，主導(dǎo)這一過程。而SHP2是RTK信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵成分，影響肌腱成熟。
肌腱隨時間逐漸發(fā)展成熟。為了系統(tǒng)地評估肌腱成熟，比較了P1，P4，P7，P10，P14和P28的跟腱。P1處圓形核細(xì)胞浸潤了新生兒肌腱。從P1到P4，細(xì)胞表現(xiàn)出逐漸細(xì)長的核形態(tài)。細(xì)胞數(shù)量從P1到P14逐漸減少。到P28時，每個區(qū)域只剩下幾個細(xì)胞。細(xì)胞外基質(zhì)在產(chǎn)后肌腱生長期間在P7處開始可見卷曲生長，并在P14處變得明顯。在發(fā)育過程中纖維直徑的變化也增加了，新生兒肌腱僅由均勻的膠原纖維組成。
在此過程中基因表達(dá)的變化，重點是細(xì)胞分化（Scx，Mkx，Egr1和Nes）和基質(zhì)產(chǎn)生（Col1a1和Tnmd）基因。在不同的時間點進(jìn)行了主成分分析（PCA）。前兩個組分在不同的時間點（P4和P7與P14和P28）適當(dāng)?shù)胤蛛x肌腱組織，P10位于中間。PCA圖（G）顯示了P7-P14時間軸上的過渡。結(jié)果表明，P7-P14是產(chǎn)后肌腱成熟過程的關(guān)鍵過渡狀態(tài)。
在P7和P14處對小鼠尾部肌腱細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq。從800個單細(xì)胞經(jīng)過濾后得到734個細(xì)胞，并分組為六個細(xì)胞群。基于差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能和肌腱相關(guān)基因的表達(dá)注釋：肌腱成纖維細(xì)胞1（簇0），肌腱成纖維細(xì)胞2（簇1），肌腱成纖維細(xì)胞3（簇2），干細(xì)胞（簇3），增殖細(xì)胞（簇4）和神經(jīng)元細(xì)胞（簇5）。
三個肌腱成纖維細(xì)胞簇高度表達(dá)的I型膠原蛋白（Col1a1和Col1a2----原纖維細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的基本構(gòu)成）。由于最大的簇0（n = 255）主要由P7肌腱細(xì)胞和高度表達(dá)的胚胎基因Pbx4組成，因此該組為未成熟的細(xì)胞簇。來自0簇細(xì)胞參與核糖核蛋白復(fù)合物的生物合成和mRNA代謝過程的調(diào)節(jié)，表明早期產(chǎn)后肌腱細(xì)胞生長的活性生物合成特征。肌腱成纖維細(xì)胞2（簇1，n = 187）和肌腱成纖維細(xì)胞3（簇2，n = 158）主要由來自P14的細(xì)胞組成，兩者都顯示出經(jīng)典ECM基因的高表達(dá)（Tnmd、Fmod 和 Thbs4），為成熟細(xì)胞簇。簇1中的細(xì)胞也高度表達(dá)Fbn1和Mfap5，與膠原原纖維組織有關(guān)。相反，簇2中的細(xì)胞主要由于機(jī)械刺激而表現(xiàn)出富集，對應(yīng)于Sparc和Serpinf1的高表達(dá)（但是這個在簇1中表達(dá)也很高）。其余三簇主要來自P7肌腱。將簇3（n = 66）注釋為具有高表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)基因：Pou3f1（Oct6），Thy1（Cd90），Nes和Ly6a（Sca-1），GO顯示在“干細(xì)胞群維持”中也顯著富集。將簇4（n = 37）分配為具有特異性表達(dá)增殖標(biāo)記Mki67的增殖細(xì)胞和G2M細(xì)胞周期階段的高得分。神經(jīng)元細(xì)胞（簇5（n = 31）高度表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物Sox2 和 Nrgn，GO富集到了“神經(jīng)發(fā)生調(diào)節(jié)”的生物過程。
為了進(jìn)一步表征未成熟肌腱和成熟肌腱之間的差異，亞群進(jìn)一步聚類。未成熟的肌腱細(xì)胞簇（簇0）可以進(jìn)一步細(xì)分為6個簇。亞簇0和1中的細(xì)胞表現(xiàn)出典型腱細(xì)胞基因的高表達(dá)，如Col1a1，Fmod，Lum和Tnmd。亞簇0也呈現(xiàn)出間充質(zhì)祖標(biāo)記物Cd9的高表達(dá)，因此被注釋為Cd9亞群，也表達(dá)軟骨細(xì)胞相關(guān)基因（如Sox9，Acan和Col2a1）。Cd9細(xì)胞主要參與對缺氧，ECM組織和軟骨細(xì)胞肥大的反應(yīng)。P7和P14肌腱中都存在Cd9簇。Cd9細(xì)胞主要富集于細(xì)胞周期停滯、干細(xì)胞分化、胚胎形態(tài)發(fā)生和發(fā)育成熟途徑。還高表達(dá)早期腱細(xì)胞的代表性標(biāo)志物Scx，Mkx和Tnc。亞簇2和亞簇3高度表達(dá)的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物，如Thy1（Cd90），Cd44和Ly6a（Sca-1）。亞簇2也高度表達(dá)肌腱標(biāo)志物Nes，因此被指定為Nes TSPCs。亞簇3顯示出內(nèi)皮標(biāo)志物（如Cd34和Pdgfra）的高表達(dá)，因此被注釋為內(nèi)皮簇。在未成熟的肌腱細(xì)胞中鑒定出一個具有Krt2，Krt10和Krt1高表達(dá)的上皮簇（亞簇4）和一個免疫細(xì)胞簇（亞簇5），具有高表達(dá)的巨噬細(xì)胞標(biāo)志物Cd68和趨化因子CCL9。
Nes TSPC，Txnip和Cd9簇表現(xiàn)出最強(qiáng)的細(xì)胞通訊。其中，Nes TSPC和Txnip簇顯示出最多的細(xì)胞間相互作用。相比之下，免疫和上皮細(xì)胞簇與其他簇的相互作用最弱，表明它們的環(huán)境支持作用。
擬時序分析顯示肌腱的增殖和干細(xì)胞群在開端，而成熟的肌腱成纖維細(xì)胞2和肌腱成纖維細(xì)胞3簇的P14在軌跡末端。（這里又是最開始的單細(xì)胞數(shù)據(jù)）
對DEG進(jìn)行了聚類分了五組。簇1中的基因從一開始就下降，主要是細(xì)胞分裂（Mki67，Top2a和Prc1）的調(diào)節(jié)和參與形態(tài)發(fā)生（Gal）的發(fā)育生長。簇2中的基因主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化（Thy1和Nes）和凋亡過程（Bax和Cav1），表現(xiàn)出沿偽時間軸逐漸下調(diào)。簇3和4基因最初上調(diào)，然后下調(diào)，分別與上皮到間充質(zhì)的轉(zhuǎn)變（Notch1，Foxa1和Fuz）和絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）活性（Cybb，Mapk311，Ret和Dusp5）的激活有關(guān)。最后，簇5中的基因在成熟過程結(jié)束時達(dá)到峰值，參與ECM組織（Ctsk，Prg4和Thbs4），對缺氧的反應(yīng)（Ang和Loxl2）以及對機(jī)械刺激的細(xì)胞反應(yīng)（Dcn和Serpine2）。免疫熒光染色結(jié)果證實，PRG4和THBS4的表達(dá)從第7天增加到第14天。
將細(xì)胞分為三種不同的狀態(tài)：早期，中期和晚期。中間過渡狀態(tài)下Cd9Cd271簇的比例顯著增加，在成熟后期狀態(tài)下降低。TGF-β和RTK信號通路主要在中期和后期得到豐富。具體而言，與早期狀態(tài)相比，F(xiàn)GF信號通路，血小板衍生生長因子（PDGF）信號通路和NGF通路在中間狀態(tài)下富集。與中間階段相比，只有胰島素生長因子（IGF）信號通路在晚期得到增強(qiáng)。Tgfb2從早期到后期被下調(diào)。Pdgfra從中間階段上調(diào)到晚期，而其配體Pdgfa表達(dá)降低。Ngf，Igf1和Fgfr1促進(jìn)肌腱成熟。
在肌腱成熟期間激活了幾種RTK家族生長因子信號通路。選擇FGF，PDGF-AA，IGF1和NGF來驗證它們在肌腱成熟過程中的作用。采用了組織外植體模型。首先檢查了這些生長因子治療組中肌腱相關(guān)基因的表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示，Tnmd在所有生長因子處理組中的表達(dá)均增加。然而，只有NGF治療組顯示肌腱主TF Scx的表達(dá)顯著增加，免疫熒光染色結(jié)果進(jìn)一步驗證了這一點。NGF治療還上調(diào)了其他肌腱相關(guān)基因的表達(dá)，如Col1a1，Col3a1，Bgn和Dcn。主要在成熟腱細(xì)胞中表達(dá)的Prg4也顯著上調(diào)。NGF組膠原纖維的平均直徑及分布范圍顯著大于對照組。這些發(fā)現(xiàn)全面證明NGF信號傳導(dǎo)可以有效促進(jìn)肌腱成熟。
后面還有一部分就是實驗驗證了SHP2參與肌腱成熟期間NGF觸發(fā)的信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)并在其中發(fā)揮不可或缺的作用。
