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無(wú)論是16S、18S、還是ITS，都是最常用的菌群多樣性分析的手段。對(duì)于新手，如果收到一份不講“情面”的16S測(cè)序結(jié)果析報(bào)告，很快就會(huì)被各種生態(tài)學(xué)術(shù)語(yǔ)、各種指數(shù)、各種分析方法弄得暈頭轉(zhuǎn)向。滿(mǎn)心喜悅完成實(shí)驗(yàn)?zāi)玫搅私Y(jié)果，如何有效運(yùn)用這些結(jié)果發(fā)高分SCI呢？今天小編帶大家一起來(lái)梳理16S測(cè)序報(bào)告，迅速理清重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象。

1. 擴(kuò)增子測(cè)序流程

首先我們要對(duì)測(cè)序過(guò)程有個(gè)基礎(chǔ)的了解，下圖為擴(kuò)增子測(cè)序流程，結(jié)題報(bào)告包括下圖的序列聚類(lèi)與數(shù)據(jù)分析兩部分。后續(xù)所有的數(shù)據(jù)分析都是基于OTU表進(jìn)行的，這張表中包括我們測(cè)的所有序列中，有多少類(lèi)型序列（OTU聚類(lèi)或ASV降噪），然后將聚類(lèi)完的類(lèi)型序列與物種數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得到我們測(cè)的所有序列中有哪些物種，每個(gè)物種有多少，即豐度的概念。

圖：擴(kuò)增子測(cè)序流程

2. 文章常用分析內(nèi)容

下圖是16s測(cè)序的分析內(nèi)容，展現(xiàn)了主要的分析內(nèi)容，每個(gè)主要分析內(nèi)容下有更細(xì)致的分析內(nèi)容，這些小的分析內(nèi)容，其實(shí)是可有選擇的使用，例如物種組成分析中有物種組成柱狀圖、分類(lèi)等級(jí)樹(shù)圖、GraPhlAn進(jìn)化樹(shù)圖、Krona物種組成圖，這幾個(gè)分析的內(nèi)容都是在解決樣本中有哪些細(xì)菌，細(xì)菌的相對(duì)豐度是多少。一般文章中常用的是物種組成柱狀圖。有的老師會(huì)認(rèn)為，文章中要包含所有的分析內(nèi)容，其實(shí)不然，我們只需要結(jié)合自己的研究預(yù)期目的選擇合適的分析內(nèi)容即可，并不是多多益善。下面我們就按照SCI文章的要求和寫(xiě)作結(jié)構(gòu)順序，一一跟大家介紹重點(diǎn)分析內(nèi)容。

3. 測(cè)序結(jié)果描述

1. 文章在材料方法描述完以后進(jìn)入結(jié)果部分，首先我們要交代一下這次測(cè)序的情況。例如我們測(cè)得的原始數(shù)據(jù)有多少，質(zhì)控后的有效數(shù)據(jù)有多少，每個(gè)樣本質(zhì)控后的有效數(shù)據(jù)占原始數(shù)據(jù)的百分比均高于百分之多少（90%），當(dāng)然所占百分比越高，本次測(cè)序的效果越好。

2. 然后我們可以描述一下稀釋曲線(xiàn)圖，稀釋曲線(xiàn)（Rarefaction curve）主要利用各樣本在不同測(cè)序深度時(shí)的微生物Alpha多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線(xiàn)，以此反映各樣本在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。若多樣性指數(shù)為sobs（表征實(shí)際觀(guān)測(cè)到的物種數(shù)目），當(dāng)曲線(xiàn)趨向平坦時(shí)，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的物種，反之則表明繼續(xù)測(cè)序還可能產(chǎn)生較多新的物種，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物多樣性信息。

3. 分類(lèi)學(xué)注釋?zhuān)傮w描述本次測(cè)序結(jié)果，例如，本次測(cè)序共得到多少門(mén)、綱、目、科、屬、種、OTU。

圖1. 稀釋曲線(xiàn)圖

4. 物種組成分析

分類(lèi)學(xué)組成分析，主要關(guān)注物種組成柱狀圖即可，這是測(cè)序中最基本的分析，通過(guò)該分析可以得到，每個(gè)樣本中有哪些物種組成，每個(gè)物種的相對(duì)豐度是多少。需要注意的是，該分析需要在具體的分類(lèi)水平上看（門(mén)、綱、目、科、屬），由于二代測(cè)序在種水平上的準(zhǔn)確率相對(duì)較低，所以在種水平上分析的較少，一般常在門(mén)和屬水平分析。描述可以從兩方面描述，一方面看主要的物種組成是什么（有哪些菌，在某一分類(lèi)的具體水平），不同的比較組之間物種組成是否有差異。另一方面看同一物種的豐度在不同組間的差異，具體描述為升高或降低。從物種組成柱狀圖中就可以來(lái)比較不同組間物種組成是否有差異，但這個(gè)差異不具有顯著性之說(shuō)。

圖2. 物種組成柱狀圖

1. Alpha多樣性分析

Alpha多樣性分析，稀釋曲線(xiàn)中已經(jīng)用到了了Alpha多樣性指數(shù)，這里的分析更加具體，可以對(duì)分組樣本進(jìn)行比較，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)T檢驗(yàn)的方法，檢測(cè)每?jī)山M之間的指數(shù)值是否具有顯著性差異。可以選擇自己要用的指數(shù)進(jìn)行比較，一般常用豐富度指數(shù)Chao值，多樣性指數(shù)Shannon，具體描述可以是豐富度與多樣性指數(shù)升高或降低，不同組間指數(shù)是否有顯著差異。Alpha多樣性分析將樣本的菌群群整體研究并轉(zhuǎn)換為具體的指數(shù)與p值，通過(guò)數(shù)字說(shuō)明群落的變化與差異，在文章中是不可或缺的。

圖3. Alpha多樣性指數(shù)圖

2. Beta多樣性分析

Beta多樣性分析，該分析是十分重要且常見(jiàn)的分析，幾乎所有的微生物測(cè)序文章中都會(huì)有此分析內(nèi)容，例如我們常見(jiàn)的PCoA、NMDS、PCA分析。通俗講就是每一個(gè)物種(ASV/OTU)在兩個(gè)樣本之間差異，即是反映這兩個(gè)樣本間群落差異的一個(gè)維度。而由于群落中物種的數(shù)量巨大，樣本間群落的差異往往是多維度的，難以進(jìn)行直接比較。此時(shí)，就需要相關(guān)算法對(duì)多維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維。降維后的結(jié)果就是平面圖中樣本點(diǎn)的距離，通過(guò)距離的遠(yuǎn)近代表樣本群落結(jié)構(gòu)的相似與差異，這里要注意的是群落結(jié)構(gòu)，因?yàn)槲覀兪菍⒚總€(gè)樣本中的每個(gè)物種都進(jìn)行了比較，不是只針對(duì)具體的某些物種，所以是從整體分析樣本之間的相似性與差異性。例如PCoA分析，我們要注意算法的選擇，如不考慮物種豐度的unweighted_unifrac，考慮物種豐度的weighted_unifrac，還有常用的bray_curtis，不同的算法會(huì)導(dǎo)致不同的結(jié)果，還需要各位投稿人結(jié)合自己的研究目的進(jìn)行選擇。

圖4. PCoA分析

3. 組間差異顯著性分析

該分析需要與Beta分析結(jié)合使用，因?yàn)镻CoA、NMDS等排序分析只是一種探索分析手段，并不是統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，對(duì)于排序圖中呈現(xiàn)的分布規(guī)律，我們需要使用檢驗(yàn)手段進(jìn)行驗(yàn)證，常用的分析有Permanova，Anosim。我們?cè)谖恼轮?strong>將Beta分析與p值結(jié)合來(lái)說(shuō)明，不同的處理是否使樣本之間的微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著差異。需要注意的是顯著性分析的算法選擇要與Beta多樣性分析相一致。

5. 物種差異分析與標(biāo)志物種

1. 韋恩圖

物種差異分析是所有老師最關(guān)注的分析。先來(lái)說(shuō)韋恩圖，該分析可以知道不同的樣本間有哪些物種是共有的，哪些是獨(dú)有的，通過(guò)數(shù)據(jù)說(shuō)話(huà)，如果共有的物種數(shù)占所有物種數(shù)的比例高，那么樣本的相似性就高。如果樣本中各自獨(dú)有的物種數(shù)所占比例高，那么樣本之間的相似性差，各自的獨(dú)特性高。

圖5. 樣本組Venn圖

2. 聚類(lèi)熱圖

物種組成熱圖也是我們常見(jiàn)的分析，將物種豐度轉(zhuǎn)換成顏色色調(diào)的冷暖，此分析看起來(lái)難以理解，其實(shí)只是視覺(jué)上的錯(cuò)覺(jué)。熱圖是在具體分類(lèi)學(xué)水平分析所有樣本中總豐度排在前幾十的物種，一般是在屬水平進(jìn)行分析。因?yàn)楹Y選了豐度，所以熱圖是對(duì)優(yōu)勢(shì)物種進(jìn)行分析。此分析包括兩方面內(nèi)容，一方面可以描述比較具體某一優(yōu)勢(shì)物種在各個(gè)樣本中的豐度高低，另一方面是描述樣本的聚類(lèi)情況，通過(guò)聚類(lèi)樹(shù)可以知道優(yōu)勢(shì)物種組成在樣本之間的相似性和差異性。

圖6. 雙聚類(lèi)的物種組成熱圖

3. 差異菌群的篩選

通過(guò)差異菌群篩選可以找出不同的處理組導(dǎo)致哪些菌群發(fā)生變化，豐度上具有顯著差異的物種，是擴(kuò)增子測(cè)序的核心目的。例如常用的Metagenomeseq和Lefse分析。MetagenomeSeq主要用于兩組樣本的差異比較。Lefse的分析更加嚴(yán)格，可以進(jìn)行多組比較，而且是在所有分類(lèi)學(xué)水平同時(shí)進(jìn)行分析。Lefse分析的結(jié)果包含了多級(jí)物種層級(jí)樹(shù)圖和LDA效應(yīng)值柱狀圖，文章中放LDA效應(yīng)值柱狀圖即可，LDA效應(yīng)值柱狀圖需要注意效應(yīng)值即該圖中的橫坐標(biāo)值，文章中一般默認(rèn)最低值為2，篩選出的物種為該組的標(biāo)志物種，這些物種的豐度顯著高于在其他組中的豐度。

圖7. 基于分類(lèi)等級(jí)樹(shù)的組間差異分類(lèi)單元圖

圖8. 標(biāo)志物種的LDA效應(yīng)值柱狀圖

4. 功能預(yù)測(cè)分析

功能預(yù)測(cè)分析，由于擴(kuò)增子測(cè)序是基因片段測(cè)序，不像宏基因組將整個(gè)基因組實(shí)際進(jìn)行測(cè)序，所以擴(kuò)增子測(cè)序只能是預(yù)測(cè)功能，與宏基因組的功能相比，預(yù)測(cè)到的信息是有限的。基于具體的功能數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋?zhuān)玫焦δ芡坟S度圖，通過(guò)功能預(yù)測(cè)可以知道有哪些功能，哪些功能的豐度相對(duì)高，也可以為進(jìn)一步做宏基因功能提供參考，另外也使文章內(nèi)容更加完善。

圖9. 預(yù)測(cè)的KEGG二級(jí)功能通路豐度圖

6. 關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析

關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析，可以用來(lái)展示樣本與物種之間的分布情況，通過(guò)對(duì)不同樣本間的物種豐度信息進(jìn)行相關(guān)性分析。在微生物生態(tài)學(xué)的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖中，每個(gè)點(diǎn)可以代表群落中的一個(gè)ASV/OTU，兩個(gè)點(diǎn)之間是正相關(guān)還是負(fù)相關(guān)可以通過(guò)連線(xiàn)的顏色進(jìn)行區(qū)分。此分析的作用是探究樣本中是否存在關(guān)系緊密的微生物，發(fā)揮特定的功能，并影響整個(gè)群落的組成變化，所以文章中是否選擇此分析必須要結(jié)合老師的研究思路。

圖10. 關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析

這里舉個(gè)例子，環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析，研究土壤的老師大都會(huì)收集土壤的各種理化因子做為環(huán)境因子數(shù)據(jù)，常見(jiàn)的分析如RDA和CCA分析，通過(guò)該分析可以反映環(huán)境因子、樣本、菌群三者之間的關(guān)系或者兩兩之間的關(guān)系，可得到影響樣本分布的重要環(huán)境驅(qū)動(dòng)因子，文章中可以描述哪些環(huán)境因子顯著影響樣本的微生物群落。

圖11. CCA分析圖

總結(jié)

微生物擴(kuò)增子測(cè)序中還有許多其它分析內(nèi)容，以上是一些常用的基礎(chǔ)分析，在文章結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)時(shí)，可以選擇其中幾個(gè)分析進(jìn)行組合，有些是必須要有的，有些則需要結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究目的進(jìn)行選擇。對(duì)于初次接觸測(cè)序的老師，一定不要被分析圖片的美貌所引誘，看起來(lái)復(fù)雜和精美的圖片可能并不能很好的解釋我們要討論的結(jié)果，反而會(huì)增加分析難度，根據(jù)文章目的取材，掌握最基礎(chǔ)的分析內(nèi)容，足以支撐起一篇文章的結(jié)構(gòu)。

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