編者按：新的方法、新技術(shù)的革命往往給科學(xué)研究帶來天翻地覆的變化。近期出現(xiàn)的CUT&Tag將繁復(fù)的ChIP-Seq變成便捷簡單的操作，為研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用提供了有效的工具。
前不久，弗雷德哈欽森癌癥研究中心的Henikoff博士在Nature Communication公開了CUT&Tag技術(shù)的詳細(xì)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)方案。與以往的ChIP-Seq、pA-MNase等方法相比，CUT&Tag技術(shù)方法簡便易行，信噪比高，重復(fù)性好，需要的細(xì)胞數(shù)量少至60個(gè)細(xì)胞，且有望將ChIP-Seq做到單細(xì)胞水平，再一次展現(xiàn)了創(chuàng)新技術(shù)方法的潛力。早在2018年5月，中國本土公司近岸蛋白質(zhì)（NOVOPROTEIN）便公開了該方法替代ChIP-Seq的可能性與核心原料ChiTagTM酶（一種Protein A與Tn5融合蛋白）的技術(shù)原理（圖1），表明中國生物技術(shù)公司已經(jīng)走出對國外公司的簡單模仿，在某些領(lǐng)域的自主創(chuàng)新能力走在了世界的前列。Henikoff博士的文章進(jìn)一步展示了ChiTag (Chromatin Immuno-Tagment)酶在解決蛋白質(zhì)-DNA相互作用的巨大潛力。圖1. CUT&Tag 原理示意圖。
CUT&Tag是蛋白質(zhì)-DNA互作關(guān)系研究的新方法，相較于傳統(tǒng)的ChIP-Seq具有以下優(yōu)點(diǎn)：省時(shí)高效，所需的細(xì)胞量少，背景信號低，可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，甚至可用于單細(xì)胞水平測序。CUT&Tag有望將蛋白與染色質(zhì)DNA互相作用的研究變成了一種類似PCR反應(yīng)的常規(guī)操作，對基因調(diào)控、表觀遺傳等領(lǐng)域的研究具有革命性的意義。在生物學(xué)研究中，DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用（DNA-Protein Interaction, DPI）是至關(guān)重要的，基因的表達(dá)、調(diào)控、復(fù)制、重組和修復(fù)，RNA的轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯和調(diào)控，都離不開DPI，幾乎所有的生命活動(dòng)都會涉及DPI。早在十九世紀(jì)后期，科學(xué)家就通過顯微鏡觀察到了蛋白質(zhì)與DNA直接的相互作用，從那以后，他們開始深入探索蛋白質(zhì)結(jié)合并控制DNA的作用機(jī)制。為了研究DPI，科學(xué)家發(fā)明了很多方法：凝膠阻滯、DNaseI足跡實(shí)驗(yàn)、甲基化干擾、體內(nèi)足跡、酵母單雜、ChIP-Seq等。其中，ChIP-Seq由于能真實(shí)、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的靶蛋白，是目前全基因組水平研究DPI的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。ChIP-Seq的基本過程包括：通過甲醛交聯(lián)將細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合的蛋白固定，再裂解細(xì)胞，超聲斷裂DNA；將DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合在特異性抗體上，利用可以結(jié)合抗體的ProteinA磁珠將抗體-蛋白-DNA復(fù)合物抓取下來，之后將DNA與蛋白解離；將DNA片段補(bǔ)平，加A，加接頭，最后進(jìn)行高通量測序。由于ChIP-Seq實(shí)驗(yàn)過程中的甲醛交聯(lián)、染色質(zhì)片段化、免疫共沉淀以及文庫構(gòu)建等步驟繁瑣且條件難以控制，常規(guī)ChIP-Seq實(shí)驗(yàn)需要大量細(xì)胞，且實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差、信噪比低。往往辛苦培養(yǎng)了很久的細(xì)胞，揮霍一空后得到大量難以分析的數(shù)據(jù)，再次實(shí)驗(yàn)又得到一堆不同的無意義數(shù)據(jù)，甚至一個(gè)技術(shù)熟練的博士消耗大半年的時(shí)間毫無進(jìn)展。這些技術(shù)上的困難限制了ChIP-Seq在DPI研究中的進(jìn)一步應(yīng)用，阻礙了表觀基因組等領(lǐng)域的發(fā)展。CUT&Tag技術(shù)的基本原理為：在抗體引導(dǎo)下，ChiTag酶僅在目的組蛋白修飾標(biāo)志、轉(zhuǎn)錄因子或染色質(zhì)調(diào)控蛋白結(jié)合染色質(zhì)的局部進(jìn)行目的DNA的片段化，同時(shí)添加測序接頭，并釋放到細(xì)胞外。由于絕大部分無關(guān)的染色質(zhì)還留在細(xì)胞核內(nèi)，因此整個(gè)實(shí)驗(yàn)的信噪比大幅提高，同時(shí)簡化了實(shí)驗(yàn)步驟。該方法可一管式高通量應(yīng)用，并可與單細(xì)胞測序平臺“無縫”結(jié)合。ChiTag酶在打斷基因組的同時(shí)加上接頭，不需要繁瑣的補(bǔ)平加A加接頭，在一天內(nèi)可以完成從細(xì)胞到測序文庫制備全流程。圖2. CUT&Tag、CUT&RUN、ChIP-Seq實(shí)驗(yàn)結(jié)果對比：CUT&Tag具有更好的信噪比和更低的背景。（見文獻(xiàn)）
圖3. 左圖：CUT&Tag、CUT&RUN、ChIP-Seq三種方法分析H3K4me1組蛋白修飾：CUT&Tag在識別染色質(zhì)特征時(shí)最有效，能夠給出ChIP-Seq無法讀出的信息；右圖： peak-Calling的對比，使用默認(rèn)參數(shù)調(diào)用每種方法上的峰值，結(jié)果顯示CUT&Tag比CUT&RUN、ChIP-seq或ATAC-seq有更高的信號。（見文獻(xiàn)）
更重要的是，CUT&Tag能夠?qū)O少量細(xì)胞（60個(gè)細(xì)胞）甚至單細(xì)胞進(jìn)行分析。由于PCR之前的反應(yīng)都在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，Henikoff博士通過分配單個(gè)細(xì)胞到5184納米孔，再加入帶隨機(jī)標(biāo)簽的引物進(jìn)行擴(kuò)增的辦法，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞測序（圖4）。圖4. CUT&Tag 單細(xì)胞測序流程（見文獻(xiàn)）
附：CUT&Tag 實(shí)驗(yàn)操作流程
ConA磁珠沉淀細(xì)胞可用低速離心代替。低速離心指600 × g離心3min，快速離心指<100 × g離心3s。1) 室溫下收集新鮮細(xì)胞置于EP管中并計(jì)數(shù)；低速離心，去溶液；
2) 管中加入細(xì)胞穿孔緩沖液重懸細(xì)胞；低速離心，去溶液；
3）管中加入細(xì)胞穿孔緩沖液再重懸細(xì)胞，輕柔震蕩并滴加Binding 緩沖液重懸的ConA磁珠，輕柔顛倒混勻5-10min；
1) 快速離心EP管，將管蓋液體離心下來，將EP管靜置于磁力架上沉淀細(xì)胞，去溶液。
2) EP管中加入預(yù)冷的抗體緩沖液將細(xì)胞重懸，輕柔震蕩后置于冰上;
3) 每管中加入0.5-1μl一抗（抗體使用生產(chǎn)商推薦濃度），輕柔震蕩；
4) 室溫下將EP管置于搖床上孵育2h；
1) 快速離心EP管，將管蓋液體離心下來，將EP管靜置于磁力架沉淀細(xì)胞，去溶液。
2) 將二抗1:100稀釋于穿孔緩沖液，加入管中，輕柔震蕩；
3) 室溫下將EP管置于搖床上孵育30-60min；
4) 快速離心細(xì)胞，將管蓋液體離心下來，EP管靜置于磁力架沉淀細(xì)胞，去溶液。
5) 管中加入0.8-1ml 穿孔緩沖液，上下顛倒10次；
6) 重復(fù)步驟4)、5) 兩次。
4. ChiTag轉(zhuǎn)座體結(jié)合抗體（1.5h）1) 快速離心EP管，將管蓋液體離心下來，將EP管靜置于磁力架沉淀細(xì)胞，去溶液。
2) 將ChiTag轉(zhuǎn)座體1:250稀釋于穿孔緩沖液2中，并滴加于細(xì)胞上，輕柔震蕩；
3) 室溫下將EP管置于搖床上孵育1h；
4) 快速離心細(xì)胞，將管蓋液體離心下來，將EP管靜置于磁力架沉淀細(xì)胞，去溶液。
5) 管中加入0.8-1ml穿孔緩沖液2，上下顛倒10次；
6) 重復(fù)步驟4)、5) 兩次。
5. 激活ChiTag轉(zhuǎn)座體，片段化目的DNA（1h）1) 快速離心EP管，將管蓋液體離心下來，將EP管靜置于磁力架沉淀細(xì)胞，去溶液。
2) 管中加入300μl ChiTag激活緩沖液，輕柔震蕩；
3) 37oC孵育1h。
7. PCR（1h），PCR之前需加入72oC，5min步驟近岸蛋白質(zhì)（NOVOPROTEIN）成立于2009年，是一家專注于蛋白質(zhì)技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用的高新技術(shù)企業(yè)。主要研究人員來自杜克大學(xué)、康奈爾大學(xué)、德州大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)、華中科技大學(xué)等知名學(xué)府。公司擁有重組蛋白質(zhì)、大容量抗體庫、結(jié)晶結(jié)構(gòu)、分子進(jìn)化等創(chuàng)新技術(shù)平臺。累計(jì)開發(fā)了13000多種重組蛋白質(zhì)，其中包括560種藥物靶點(diǎn)蛋白、50余種NGS與分子診斷用酶、200余種診斷抗體抗原、2000余種類器官與細(xì)胞培養(yǎng)因子等科研試劑。為國內(nèi)外三百多家抗體藥物公司與數(shù)千家科研機(jī)構(gòu)及診斷試劑公司提供高品質(zhì)蛋白質(zhì)支持，產(chǎn)品被上千篇SCI論文引用。 電話：(021)5079-8060/400-600-0940
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