目前，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)已成功應(yīng)用于解析腫瘤微環(huán)境（TME）中正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的亞群和基因表達(dá)。同時(shí)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，使并行檢測(cè)數(shù)以萬(wàn)計(jì)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組信息也成為可能。
然而，大規(guī)模腫瘤相關(guān)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是在如何有效地從TME的基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞中區(qū)分出腫瘤細(xì)胞，使得能更深入的研究腫瘤細(xì)胞。前期研究表明，鑒別腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的有效方法為鑒別非整倍體拷貝數(shù)（Aneuploid copy number profiles），這是因?yàn)榉钦扼w拷貝數(shù)在大多數(shù)人類腫瘤中很常見（88%），而在具有二倍體基因組的基質(zhì)細(xì)胞類型中則不存在。
前人在該領(lǐng)域也進(jìn)行了探索，比如inferCNV和HoneyBadger方法的建立，這些方法可以從足夠大的基因組區(qū)域的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中估算基因組拷貝數(shù)。然而，這些方法是為分析來(lái)自第一代單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)數(shù)據(jù)而設(shè)計(jì)的，第一代單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)具有較高的測(cè)序深度。但是，這些方法并不適用于新開發(fā)的高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)平臺(tái)的數(shù)據(jù)分析（如10X Genomics），因?yàn)楦咄繂渭?xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)僅對(duì)mRNA的3 '或5 '端進(jìn)行較低深度的測(cè)序。此外，以前的方法不能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)染色體斷點(diǎn)的基因組位置，也不能根據(jù)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的非整倍體拷貝數(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類。
為了應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，來(lái)自休斯頓衛(wèi)理公會(huì)研究所、德克薩斯大學(xué)安德森癌癥中心等單位的研究人員開發(fā)了CopyKAT，并以長(zhǎng)文的形式發(fā)表在Nature Biotechnology，題目為 “Delineating copy number and clonal substructure in human tumors from single-cell transcriptomes”。該研究表明，CopyKAT可以應(yīng)用于人類多種腫瘤的研究，以識(shí)別非整倍體腫瘤細(xì)胞，并描繪腫瘤細(xì)胞中共存的不同亞群的克隆亞結(jié)構(gòu)。
CopyKAT算法概述
首先，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的Unique Molecular Identifier（UMI）的基因表達(dá)矩陣作為CopyKAT的輸入，通過(guò)它們的基因組坐標(biāo)對(duì)它們進(jìn)行排序，并對(duì)基因的排列進(jìn)行注釋。之后，用Freeman-Tukey變換來(lái)穩(wěn)定方差，然后采用多項(xiàng)式動(dòng)態(tài)線性建模矯正單細(xì)胞UMI計(jì)數(shù)矩陣中的異常值。
下一步是建立一個(gè)高可信度的正常二倍體細(xì)胞子集，用來(lái)推測(cè)正常二倍體細(xì)胞的拷貝數(shù)基線值。為此，研究人員將所有單細(xì)胞集中到幾個(gè)小的亞群分類中，并使用高斯混合模型估算每個(gè)分類的方差。通過(guò)嚴(yán)格的分類標(biāo)準(zhǔn)，具有最小估計(jì)方差的聚類被定義為“標(biāo)準(zhǔn)的二倍體細(xì)胞”。
為了檢測(cè)染色體斷點(diǎn)，他們整合泊松-伽瑪模型和馬爾可夫鏈蒙特卡羅迭代生成每個(gè)基因窗口的后驗(yàn)均值，然后應(yīng)用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)對(duì)均值無(wú)顯著差異的相鄰窗口進(jìn)行合并，然后計(jì)算每個(gè)窗口的最終拷貝數(shù)值，以此作為跨越每個(gè)細(xì)胞中相鄰染色體斷點(diǎn)的所有基因的后驗(yàn)平均值。
然后對(duì)單細(xì)胞拷貝數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行分層聚類，以確定非整倍體腫瘤細(xì)胞和二倍體基質(zhì)細(xì)胞之間的最大距離。最后，根據(jù)聚類信息識(shí)別克隆亞群，并計(jì)算代表亞克隆基因型的共表達(dá)譜，進(jìn)一步分析其基因表達(dá)的差異。
CopyKAT性能的評(píng)估
研究結(jié)果表明，在220 kb的基因組分辨率下，CopyKAT的預(yù)測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)參考DNA拷貝數(shù)信息具有很高的一致性（皮爾森相關(guān)系數(shù)為0.82）。inferCNV的預(yù)測(cè)結(jié)果也具有較高的一致性（皮爾森相關(guān)系數(shù)為0.79）。然而，inferCNV的主要局限性是不能檢測(cè)染色體斷點(diǎn)的具體坐標(biāo)或拷貝數(shù)片段，而CopyKAT則可以實(shí)現(xiàn)這些。
接下來(lái)，通過(guò)在不同基因大小區(qū)間的相鄰局部區(qū)域重復(fù)采樣，他們進(jìn)一步計(jì)算了從兩種方法推斷的拷貝數(shù)狀態(tài)與參考DNA拷貝數(shù)信息的相對(duì)差距。分析結(jié)果表明與inferCNV相比，CopyKAT更接近參考DNA拷貝數(shù)狀態(tài)（P < 0.001, t檢驗(yàn)）。此外，數(shù)據(jù)還表明，在5 ~ 500個(gè)基因區(qū)間內(nèi)，CopyKAT具有更穩(wěn)定的表現(xiàn)。
圖3. CopyKAT與inferCNV性能的比較（二），來(lái)源：Nature Biotechnology
CopyKAT性能的檢測(cè)：實(shí)體瘤中腫瘤與正常細(xì)胞的分類
結(jié)果表明，CopyKAT具有很好的區(qū)分能力，比如根據(jù)5例胰腺癌患者的9,717個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，CopyKAT成功地在所有個(gè)體中鑒定出非整倍體腫瘤細(xì)胞亞群。預(yù)測(cè)的腫瘤細(xì)胞具有全基因組拷貝數(shù)異常，包括頻繁擴(kuò)增的1q、3q、7p、8q、17、19和20以及缺失的3p、6和8p，這與之前的研究報(bào)道是一致的。同時(shí)，預(yù)測(cè)得到的非整倍體腫瘤細(xì)胞的UMAP投射與表現(xiàn)出高上皮基因得分的細(xì)胞亞群共定位，這也體現(xiàn)了這些細(xì)胞的腫瘤特性。
圖4. CopyKAT可將人類腫瘤中癌細(xì)胞和正常細(xì)胞分類，來(lái)源：Nature Biotechnology
CopyKAT可應(yīng)用于其他單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)
推測(cè)乳腺腫瘤的克隆亞結(jié)構(gòu)
結(jié)果表明，CopyKAT能夠區(qū)分出腫瘤細(xì)胞的亞克隆結(jié)構(gòu)，比如克隆A的亞克隆擴(kuò)增（4p, 7q, 9p13.2-q22.2和17q）；克隆B的亞克隆擴(kuò)增（3p26.3-p25.1, 6q, 7p, 11q，Xp11.23和Xq）。
差異分析在兩個(gè)亞克隆中共鑒定出329個(gè)差異表達(dá)基因，在亞克隆A中，包括雄激素反應(yīng)和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等特征顯著富集；并且這兩個(gè)預(yù)測(cè)出的非整倍體亞克隆在降維圖上也對(duì)應(yīng)不同的細(xì)胞亞群。因此，這些結(jié)果表明，CopyKAT可以從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中解析腫瘤的克隆拷貝數(shù)亞結(jié)構(gòu)，并識(shí)別出亞克隆的差異。
聯(lián)系客服
