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從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的思路解析山東卷25題（含視頻詳解）

2021.11.26

（2021·山東卷）25.（12分）人類γ基因啟動子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A 蛋白結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)結(jié)合BCL11A蛋白后，γ基因的表達(dá)被抑制。通過改變該結(jié)合位點(diǎn)的序列，解除對γ基因表達(dá)的抑制，可對某種地中海貧血癥進(jìn)行基因治療?？蒲腥藛T擴(kuò)增了γ基因上游不同長度的片段，將這些片段分別插入表達(dá)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和熒光檢測，以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)的具體位置。相關(guān)信息如圖所示。

（1）為將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)熒光蛋白基因表達(dá)，需在引物末端添加限制酶識別序列。據(jù)圖可知，在F1～F7末端添加的序列所對應(yīng)的限制酶是______，在R末端添加的序列所對應(yīng)的限制酶是_______。本實(shí)驗(yàn)中,從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個(gè)過程共需要______種酶。

解析：首先我們把這個(gè)題目定位為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)題。

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?span style="font-family: 宋體;text-align: left;">確定BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)的具體位置（換句話說，就是確定BCL11A蛋白到底與F1～F7中的哪個(gè)片段結(jié)合）。

實(shí)驗(yàn)原理：F1～F7片段結(jié)合在熒光蛋白基因的上游，一旦BCL11A蛋白與F1～F7中的某個(gè)片段結(jié)合，熒光蛋白的基因表達(dá)就會被抑制，從而模擬了γ基因的表達(dá)被抑制的情境。

實(shí)驗(yàn)步驟：（1）擴(kuò)增了γ基因上游不同長度的片段，即通過PCR技術(shù)分別擴(kuò)增F1～F7片段；

（2）構(gòu)建重組DNA分子：讓F1～F7片段分別與表達(dá)載體重組。（因此需要用限制性核酸內(nèi)切酶處理表達(dá)載體和擴(kuò)增的F1～F7片段，為了保障重組的順利完成，要用限制酶切除相同的粘性末端，當(dāng)然最后用兩種限制酶，這樣可以避免環(huán)化）

（3）將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，通過熒光蛋白基因是否表達(dá)，來判斷BCL11A蛋白到底與F1～F7中的哪個(gè)片段結(jié)合。

這里需要說明的兩點(diǎn)是：①將構(gòu)建的載體導(dǎo)入除去BCL11A基因的受體細(xì)胞；②表達(dá)載體上的BCL11A基因要表達(dá)的前提是雌激素的存在；

視頻詳解

（2）將構(gòu)建的載體導(dǎo)入除去BCL11A基因的受體細(xì)胞，成功轉(zhuǎn)化后，含F(xiàn)1～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的載體表達(dá)熒光蛋白，受體細(xì)胞有熒光，含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光。含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光的原因是___________________________。

（3）向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，含F(xiàn)1～F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光，而含F(xiàn)5～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光。若γ基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對應(yīng)的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)序列，據(jù)此結(jié)果可推測，BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于___________，理由是_______________________________________________。

【答案】（1）SalⅠ EcoRⅠ 6

（2）F7與R擴(kuò)增產(chǎn)物不含完整的啟動子，熒光蛋白基因不表達(dá)

（3）引物F4與F5在調(diào)控序列上所對應(yīng)序列之間的區(qū)段上根據(jù)有無熒光情況判斷，F(xiàn)1～F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物上均有結(jié)合位點(diǎn)，因此結(jié)合位點(diǎn)位于F4所對應(yīng)調(diào)控序列的下游（右側(cè)）；F5～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物上均無結(jié)合位點(diǎn)，可知結(jié)合位點(diǎn)位于F5所對應(yīng)調(diào)控序列的上游（左側(cè)），所以結(jié)合位點(diǎn)位于引物F4與F5在調(diào)控序列上所對應(yīng)序列之間的區(qū)段上

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