三級淋巴結(jié)構(gòu)（Tertiary lymphoid structure，TLS）是存在于腫瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病、器官移植等疾病慢性炎癥部位周圍的異位淋巴組織，其結(jié)構(gòu)和功能與次級淋巴器官相似，是腫瘤微環(huán)境中抗腫瘤免疫應(yīng)答啟動的直接部位，對患者生存預(yù)后、治療反應(yīng)及免疫治療應(yīng)答評估均有積極作用。
TLS因其直接的位置分布及強大的免疫功能，在腫瘤免疫治療中被寄予厚望。在腫瘤中，TLS的形成象征免疫細胞的浸潤及對腫瘤的殺傷作用的增強，是患者生存和預(yù)后的積極因素。TLS是組成腫瘤微環(huán)境的重要因素，是腫瘤免疫應(yīng)答的直接啟動部位，可以更好地誘導(dǎo)T細胞啟動，防止T細胞衰竭或無能，其密度對腫瘤的預(yù)后有預(yù)測作用。在免疫低腫瘤和免疫高腫瘤中誘導(dǎo)TLS新生，與抑制炎性環(huán)境和/或免疫檢查點抑制劑的治療劑組合的策略，代表了癌癥治療的新希望。
當(dāng)腫瘤發(fā)生時，TLS通常在腫瘤浸潤部位產(chǎn)生。TLS在抵抗腫瘤的過程中起到積極作用，目前已有較多關(guān)于TLS提高腫瘤免疫的機理及其臨床應(yīng)用已經(jīng)有了非常多的報道。本期我們將對如何利用HALO數(shù)字病理圖像分析平臺，對TLS的識別、組成與結(jié)構(gòu)、定量檢測以及在臨床前研究進行介紹。
首先小編帶大家先了解下TLS的組成及常見的檢測標(biāo)記物。TLS是異位淋巴細胞聚集形成的組織，有許多免疫細胞參與其組成，包括B細胞，濾泡樹突狀細胞 (FDC)，漿細胞、T細胞，成纖維網(wǎng)狀細胞 (FRC)，基質(zhì)細胞，樹突細胞，中性粒細胞，巨噬細胞，以及內(nèi)皮細胞等。其中，F(xiàn)DC通常位于B細胞中心，表達各類受體，促進抗原遞呈至B細胞以及促進B細胞表達高活性的抗體。內(nèi)皮細胞位于TLS邊緣。此外，在T細胞區(qū)域內(nèi)，也有一些FRC，此類細胞與體內(nèi)微環(huán)境結(jié)合，調(diào)解T細胞的功能。TLS可以以不同的成熟狀態(tài)存在于腫瘤組織中，最高級可以形成生發(fā)中心結(jié)構(gòu)。
圖1 癌癥中TLS的組成結(jié)構(gòu)
不同細胞在免疫組化中可以被不同的標(biāo)記物染色，可用于對TLS 的鑒定和識別。表1列出了常用的TLS成分的檢測標(biāo)記物。
表1 TLSs的組成及標(biāo)記物的檢測
與腫瘤微環(huán)境相關(guān)的細胞類型較多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不同類型的腫瘤具有不同的TME。如何從組織中識別檢測和量化TLS 是目前的熱點問題。下面我們通過幾篇關(guān)于HALO在TLS研究中的應(yīng)用來介紹如何在腫瘤微環(huán)境中對TLS進行研究。
01 B細胞的浸潤以及TLS作為軟組織肉瘤患者的預(yù)后及免疫治療生物標(biāo)記物
法國國家健康與醫(yī)學(xué)研究院的免疫學(xué)教授Wolf Fridman通過分析軟組織肉瘤（STS）臨床隊列研究，發(fā)現(xiàn)軟組織肉瘤中B細胞的浸潤以及三級淋巴結(jié)構(gòu)與病人的預(yù)后以及對免疫治療的響應(yīng)呈正相關(guān)。
為了探索軟組織肉瘤響應(yīng)免疫治療的機制，研究團隊從分析STS腫瘤微環(huán)境中免疫細胞組成入手，分析了608個軟組織肉瘤的基因表達譜。根據(jù)免疫相關(guān)基因表達的多少，將STS分為五類不同的肉瘤免疫類型（sarcoma immune classes，SICs），標(biāo)記為A、B、C、D和E。其中SIC A為免疫匱乏型，低表達免疫細胞和血管內(nèi)皮細胞相關(guān)基因；SIC B的免疫組成復(fù)雜，總體免疫反應(yīng)弱；SIC C高表達血管內(nèi)皮細胞相關(guān)基因；SIC D的免疫組成也為異質(zhì)性，但總體免疫反應(yīng)強；SIC E高表達免疫細胞相關(guān)基因，特別是B細胞相關(guān)基因，T細胞活化相關(guān)基因以及免疫檢查點基因的表達在E亞群中表達也較高。
隨后探索不同SIC組的臨床生存情況，發(fā)現(xiàn)和SIC D和E相比，SIC A具有更短的總體生存率。表明根據(jù)免疫微環(huán)境組成對軟組織肉瘤進行分類能夠較好的預(yù)測腫瘤患者生存率。由于SIC E中高表達B細胞和T細胞相關(guān)基因，根據(jù)T, B細胞分別對腫瘤患者重新進行生存分析，發(fā)現(xiàn)和CD8+ T細胞表達特征相比，B細胞表達特征與更好的總體生存情況呈正相關(guān)（圖2）。
圖2 根據(jù)CD8 T細胞或B細胞系的表達特征對STS患者進行生存分析
三級淋巴結(jié)構(gòu)（TLS）是機體中的異位淋巴器官，其在腫瘤部位的非淋巴組織中發(fā)展，主要由T細胞，B細胞和DC細胞組成。對STS腫瘤組織進行免疫染色，發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)強的SIC E中存在大量TLS，且TLS表現(xiàn)為更成熟的次級濾泡樣TLS，有TLS的腫瘤中也有更多的T細胞和B細胞的浸潤；而免疫反應(yīng)弱的SIC A中基本不含有三級淋巴結(jié)構(gòu)（圖3）。這表明三級淋巴結(jié)構(gòu)可以作為免疫反應(yīng)強的軟組織肉瘤的標(biāo)志物，并且與腫瘤患者預(yù)后呈正相關(guān)。
圖3 TLSs是免疫高級別STS的一個顯著特征。
最后作者探索免疫微環(huán)境組成是否也能預(yù)測患者對PD1等免疫檢查點阻斷療法的響應(yīng)性。使用pembrolizumab（PD1單抗）對47個軟組織肉瘤患者進行治療，結(jié)果顯示SIC E組對ICB治療有更好的響應(yīng)和總體生存情況（圖4）。這表明這種新型軟組織肉瘤分類方法有助于預(yù)測腫瘤患者對PD1免疫療法的敏感性。也就是說，STS中免疫細胞浸潤的多少以及類型與腫瘤的預(yù)后以及對CPI治療的響應(yīng)密切相關(guān)。
圖4 肉瘤免疫微環(huán)境免疫類型對PD-1免疫檢查點抑制劑治療的反應(yīng)密切相關(guān)
該研究根據(jù)免疫微環(huán)境組成這個全新的視角對軟組織肉瘤進行分類，發(fā)現(xiàn)該種分類方式能夠較好的預(yù)測病人對PD1免疫療法的敏感性，并且還揭示B細胞以及三級淋巴結(jié)構(gòu)在腫瘤免疫治療中的重要作用。在研究中，對于TLS的評估，使用HALO圖像分析平臺進行TILS的識別。當(dāng)發(fā)現(xiàn)DC-LAMP染色的CD3聚集簇與CD20聚集簇同時高表達時，認為是腫瘤呈TLS陽性。另外，分析中只考慮60000μm2以上，總細胞數(shù)大于700個細胞且CD20陽性細胞不少于350個以上的聚集簇。
02 TLS與局部晚期尿路上皮癌治療的完全緩解相關(guān)（NABUCCO試驗）
抗PD1和抗CTLA4抗體的術(shù)前免疫療法在黑色素瘤和大腸癌中顯示出顯著的病理反應(yīng)。荷蘭癌癥研究所的團隊在開展的NABUCCO（NCT03387761）的單臂可行性試驗中，研究了接受兩劑ipilimumab和兩劑nivolumab治療的24例III期尿路上皮癌（UC）患者切除的組織樣本。
發(fā)現(xiàn)11名患者（46％）出現(xiàn)病理完全緩解（pCR），達到了次要療效終點。14名患者（58％）沒有剩余的浸潤性疾?。╬CR或pTisN0/pTaN0）。與抗PD1/PD-L1單一療法的研究相比，ipilimumab + nivolumab的完全應(yīng)答與CD8+或T效應(yīng)細胞的基本存在情況無關(guān)。在應(yīng)答的患者中觀察到治療后誘導(dǎo)的三級淋巴結(jié)構(gòu)初步形成。這些結(jié)果表明，CTLA-4聯(lián)合PD-1阻斷可能是有效的術(shù)前治療策略。
在研究過程中，作者使用多重免疫熒光染色和HALO定量圖像分析的方法對TLS的結(jié)構(gòu)進行可視化分析并量化TLS的成熟階段?；€TLS的數(shù)量與治療反應(yīng)之間未觀察到相關(guān)性。治療反應(yīng)的分析顯示，達到CR的患者腫瘤中TLS顯著富集。研究中HALO識別尿路上皮癌組織中腫瘤、間質(zhì)組織分型，并定量檢測CD3、CD8、FoxP3、CD68、CD20及Pan-CK腫瘤免疫細胞的浸潤程度。（圖5）
圖5 術(shù)前ipilimumab和nivolumab的B細胞分析和TLS動態(tài)評估
03 TLS作為新輔助療法治療不符合順鉑化療的可手術(shù)性高危尿路上皮癌的預(yù)測性生物標(biāo)記物
免疫檢查點療法正在針對局部尿路上皮癌的新輔助治療中進行測試，美國德州大學(xué)MD安德森癌癥中心的研究人員將免疫檢查點抑制劑Tremelimumab（抗CTLA-4）和Durvalumab（抗PD-1）聯(lián)合進行治療局部尿路上皮癌，得到了安全性和療效較好的治療結(jié)果。
對于尿路上皮癌患者，標(biāo)準(zhǔn)療法包括基于順鉑的化療，然后進行手術(shù)。但是由于腎功能不佳，心力衰竭或神經(jīng)病等疾病，多達一半的患者不符合順鉑治療的條件，因此沒有標(biāo)準(zhǔn)的治療選擇。該研究招募了28例不符合順鉑標(biāo)準(zhǔn)治療的高危局部尿路上皮癌患者，每位患者均接受了兩種劑量的Durvalumab和Tremelimumab的聯(lián)合治療，有24位患者在治療后完成了手術(shù)。其中9例（37.5％）達到了病理完全緩解（pCR），這意味著手術(shù)時沒有明顯的癌癥跡象。此外，在12例腫瘤特別大的患者（T3-T4期）中，pCR率為42％，一半的患者腫瘤大小降至T1期或更小。大多數(shù)患者經(jīng)歷了與免疫相關(guān)的副作用，其中最常見的是1-2級皮疹（29％）和無癥狀的淀粉酶升高（29％）。6名患者（21％）經(jīng)歷了3級或更高的免疫相關(guān)副作用，包括無癥狀的實驗室異常，肝炎和結(jié)腸炎。沒有發(fā)生與治療有關(guān)的死亡。
研究人員還收集了患者治療前后的血液和組織樣本，以及與反應(yīng)相關(guān)的生物標(biāo)記物。他們從對聯(lián)合療法反應(yīng)良好的患者的治療前腫瘤樣本中發(fā)現(xiàn)了更高密度的稱為三級淋巴結(jié)構(gòu)（TLS）的免疫細胞簇，TLS密度越高，總體生存期越長，無復(fù)發(fā)生存率越高（圖6）。盡管這些發(fā)現(xiàn)需要在更大的研究中得到證實，但數(shù)據(jù)表明TLS可以作為對免疫檢查點阻斷有反應(yīng)的患者有用的預(yù)測性生物標(biāo)志物。
本研究中通過表達CD20和CD3的淋巴細胞聚集簇，以及形態(tài)上與生發(fā)中心內(nèi)的淋巴組織相似定義TLS。對單標(biāo)記IHC分析，使用HALO進行了全面的評估，包括TLS中的CD20、CD4、CD8的陽性細胞數(shù)及細胞密度。
圖6 治療前腫瘤組織樣本中TLS的分布及與生存期分析
04 三級淋巴結(jié)構(gòu)中B細胞異質(zhì)性與轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的生存相關(guān)
TLS是外周組織中的免疫聚集體，可以支持適應(yīng)性免疫反應(yīng)。它們的存在與檢查點阻斷療法 (CBT) 的臨床反應(yīng)有關(guān)，但尚不清楚 TLS 是否具有獨立于黑色素瘤 CBT 的預(yù)后意義。研究假設(shè)黑色素瘤轉(zhuǎn)移中的 TLS 與腫瘤內(nèi)淋巴細胞浸潤增加有關(guān)，但 TLS 內(nèi)免疫環(huán)境與腫瘤內(nèi)免疫環(huán)境不同。同時還假設(shè) TLS 的存在與生存率的提高有關(guān)，并且 TLS 成熟或 TLS 內(nèi)淋巴細胞活性也與生存率相關(guān)。
來自弗吉尼亞健康系統(tǒng)大學(xué)的Kevin博士對來自64名皮膚黑色素瘤轉(zhuǎn)移 (CMM) 的患者樣本通過多重免疫熒光評估 TLS 的存在和成熟狀態(tài)。分析了TLS的淋巴細胞密度，增殖和 B 細胞 Ig 體細胞超變 (AID+)，以及T細胞耗竭和 Th1/Tc1 分化的標(biāo)志物。評估了TLS成熟與TLS內(nèi)免疫活性之間的關(guān)聯(lián)，以及與腫瘤內(nèi)免疫細胞浸潤的關(guān)聯(lián)。
研究發(fā)現(xiàn)在64名 CMM (TLS+) 中的 30 名 (47%) 中發(fā)現(xiàn)了 TLS，并且與腫瘤內(nèi)淋巴細胞浸潤增加有關(guān)。然而，TLS 內(nèi)淋巴細胞的增殖與腫瘤內(nèi)淋巴細胞增殖無關(guān)。大多數(shù)是早期的 TLS，初級或次級濾泡樣 TLS 的子集也存在。在多變量分析中，TLS+ 病變與轉(zhuǎn)移瘤切除術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險較低以及 OS 改善相關(guān)。CD21+ B 細胞比例低的 TLS 的 OS 更長，而 AID+ B 細胞比例低的 TLS 的 OS 更短）。
該研究中，作者使用HALO對TLS內(nèi)淋巴細胞的數(shù)量、密度進行了全方面的分析。例如進行淋巴細胞密度的分析并進行細胞密度歸一化處理，計算出表達某一激活或分化標(biāo)記物的分數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)化密度用于所有TLS內(nèi)或腫瘤內(nèi)淋巴細胞激活或分化標(biāo)記表達的比較，以及所有與TLS內(nèi)淋巴細胞表達這些標(biāo)記相關(guān)的患者預(yù)后評估。
圖7 TLS圖像示例及免疫細胞密度評估
圖8 eTLS早期三級淋巴結(jié)構(gòu)、pTLS原發(fā)性濾泡樣三級淋巴結(jié)構(gòu)、sTLS次生濾泡樣三級淋巴結(jié)構(gòu)的代表性圖像(分別為左、中、右列)。(A) CD20+CD21+CD23+染色；(B) CD20+染色；(C) CD21+網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的染色(pTLS和sTLS)；(D) CD23+生發(fā)中心樣結(jié)構(gòu)(僅sTLS)。
TLS因為其特殊的分布位置以及強大的免疫功能，在腫瘤免疫過程中發(fā)揮越來越大的功能。使用HALO數(shù)字病理圖像分析平臺，可以全方位的對腫瘤微環(huán)境內(nèi)TLS的數(shù)量、空間位置分布以及TLS內(nèi)淋巴細胞的數(shù)量、表型等信息進行全方面的分析。聯(lián)合空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析策略，可以針對TLS的特殊結(jié)構(gòu)、細胞組成與基因表達情況，深入解析腫瘤的免疫機制和臨床免疫治療，在未來的科學(xué)領(lǐng)域?qū)l(fā)揮重要的作用。
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