哈佛大學(xué)和麻省理工學(xué)院近期發(fā)表了“High-throughput RNA isoform sequencing using programmable cDNA concatenation.”研究論文中，將 cDNA 串聯(lián)成可用于長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序最佳的單分子的技術(shù)應(yīng)用于腫瘤浸潤(rùn) T 細(xì)胞的單細(xì)胞 RNA 測(cè)序,提高了尋找可變剪接基因的準(zhǔn)確度，驗(yàn)證了 T 細(xì)胞中典型的 PTPRC 剪接模式和相關(guān) hnRNPLL 剪接因子的協(xié)同表達(dá)。
發(fā)表時(shí)間：2021
樣本類型：腫瘤浸潤(rùn)性T細(xì)胞
客戶單位：哈佛大學(xué)和麻省理工學(xué)院
可變剪接是真核生物轉(zhuǎn)錄本成熟過程中通過差異外顯子和（或）UTR剪接調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、表達(dá)和定位的核心調(diào)控過程，使用三代全長(zhǎng)RNA測(cè)序能夠捕獲完整的轉(zhuǎn)錄本同源異構(gòu)體?；趩渭?xì)胞分辨率下RNA同源異構(gòu)體的精確量化仍然是一個(gè)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，MAS-ISO-seq技術(shù)通過程序性串聯(lián)cDNA成單分子，可能在精確量化方面優(yōu)于Pacbio測(cè)序技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
使用合成RNA同源異構(gòu)體庫(kù)驗(yàn)證了MAS ISO序列的可以明確同源異構(gòu)體分配，并將此方法應(yīng)用于腫瘤浸潤(rùn)性T細(xì)胞的單細(xì)胞RNA序列測(cè)定。圖 測(cè)序方法的讀長(zhǎng)和通量示意圖
二代測(cè)序平臺(tái)（例如Illumina）實(shí)現(xiàn)了高通量（>1x109reads），但讀長(zhǎng)（50-600 bp）阻礙了它的發(fā)展，因?yàn)檫@些讀長(zhǎng)不足以跨越大多數(shù)人類轉(zhuǎn)錄本（1.6±1.1 kb）。二代測(cè)序的短讀通常無法跨越連續(xù)的剪接位點(diǎn)，從而影響了正確識(shí)別轉(zhuǎn)錄同源異構(gòu)體。三代平臺(tái)Oxford Nanopore（ONT）和PacBio能夠?qū)崿F(xiàn)全長(zhǎng)RNA同源異構(gòu)體測(cè)序，但其通量相對(duì)較低，成本較高且Sequel IIe儀器的CCS序列達(dá)到~10循環(huán)的最佳文庫(kù)大小為15-20 kb，由于轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度（單個(gè)轉(zhuǎn)錄本的平均長(zhǎng)度為100bp-5kb）短于文庫(kù)大小，會(huì)造成一些循環(huán)的浪費(fèi)。MAS-ISO-seq開創(chuàng)性的將 cDNA 均分成 15 份，每份的兩端分別連接帶有 U 的不同小片段，后續(xù)通過粘性末端互補(bǔ)配對(duì)將不同文庫(kù)的相同末端片段首尾連接，實(shí)現(xiàn)了 15 個(gè)不同 cDNA 分子隨機(jī)有方向的串聯(lián)，大大增加了上機(jī)測(cè)序的最終 cDNA 長(zhǎng)度和最終有效全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)出。由于極大的提高了測(cè)序產(chǎn)出和完整性，此方案可以在三代測(cè)序上直接實(shí)現(xiàn)基于定量和結(jié)構(gòu)上的同時(shí)分析，從而實(shí)現(xiàn)精確測(cè)序和PacBio平臺(tái)更優(yōu)化的利用率。結(jié)合通過鏈親和素/生物素選擇上游消除TSO引物，MAS-ISO-seq將測(cè)序量提高到每個(gè) Cell 約4000萬全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，比CCS校正的reads增加了15倍以上（圖1b）。Lexogen SIRV-Set 4是一種合成的加標(biāo) RNA 異構(gòu)體 (SIRVs) 混合物，對(duì)Lexogen SIRV Set 4進(jìn)行了全長(zhǎng)RNA測(cè)序，以比較二代測(cè)序得到的同源異構(gòu)體和高通量長(zhǎng)讀測(cè)序方法異同，特別指出ERCC 結(jié)果兩種方案之間總體上大致相似。MAS-ISO-seq和ISO seq與Smart-seq3方法相比，MAS-ISO-seq序列直接識(shí)別轉(zhuǎn)錄同源異構(gòu)體，獲得的同源異構(gòu)體分配幾乎無錯(cuò)誤（圖1f）。圖1 MAS-ISO-seq工作流和使用合成RNA同源異構(gòu)體的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
為了驗(yàn)證MAS-ISO-seq，使用cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)試，即對(duì)腫瘤浸潤(rùn)的CD8 + T細(xì)胞進(jìn)行了10x Genomics 5’端單細(xì)胞測(cè)序，其中獲得了6260個(gè)CD8 + T細(xì)胞，盡管二代和三代方法和定量方法在測(cè)序深度上存在較大差異，但細(xì)胞聚類和基因表達(dá)高度一致（圖2）。利用T細(xì)胞分化過程中CD45（PTPRC）的不同剪接模式，使用 CITE-seq 在蛋白質(zhì)水平上對(duì)CD45同源異構(gòu)體表達(dá)進(jìn)行了正交驗(yàn)證，并將其與MAS-ISO-seq測(cè)量的mRNA水平進(jìn)行了比較。這兩種模式之間的CD45亞形表達(dá)高度一致（圖2c）。擬時(shí)序分析揭示了 T 細(xì)胞狀態(tài)的連續(xù)統(tǒng)一性，從干細(xì)胞樣到活化再到終末分化。清晰的追蹤到了典型的 CD45 亞型表達(dá)及其相關(guān)的剪接因子 hnRNPLL11 沿著這一分化的軌跡（圖2d-f）。為了量化MAS-ISO-seq的測(cè)序深度對(duì)細(xì)胞分型和差異剪接基因鑒定的影響，通過ARI電子下采樣分析確定了每個(gè)數(shù)據(jù)集T細(xì)胞同源異構(gòu)體中差異剪接基因的數(shù)量，識(shí)別到差異剪接基因增加了34倍（圖2g）。圖2 用MAS-ISO-seq對(duì)人CD8+T細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞同源異構(gòu)體測(cè)序
MAS-ISO-seq 是一種程序化串聯(lián)cDNA并進(jìn)行長(zhǎng)讀段測(cè)序的單分子技術(shù)，與Sequel IIe 測(cè)序儀相比可以將通量提高15倍以上。使用已知的同源異構(gòu)體文庫(kù)用 MAS-ISO-seq 驗(yàn)證了其準(zhǔn)確性，并將這種方法應(yīng)用于腫瘤浸潤(rùn) T 細(xì)胞的單細(xì)胞 RNA 測(cè)序。結(jié)果表明，可以準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)差異剪接基因和典型的 PTPRC 剪接模式相關(guān) hnRNPLL 剪接因子。MAS-ISO-seq 等方法將推動(dòng)同源異構(gòu)體的發(fā)現(xiàn)和從基因表達(dá)到轉(zhuǎn)錄亞型表達(dá)分析的轉(zhuǎn)變。參考文獻(xiàn)
High-throughput RNA isoform sequencing using programmable cDNA concatenation. 2021.
